研究背景:单纯自体脂肪移植存活率波动较大,常需多次注射。近期研究发现在自体颗粒脂肪中加入脂肪源性干细胞（ADSCs）可在一定程度上提高移植物的存活率,但最终的存活率与混入ADSCs的生物学活性密切相关。自噬是真核细胞的一种自我保护机制,上调自噬有望在移植后早期的缺血乏氧状态下,提高ADSCs在面对应激刺激时的活性,同时改善其旁分泌功能,最终促进移植脂肪的存活。但上调自噬改善ADSCs活性的机制尚不明确,目前亦未见调控ADSCs自噬对自体脂肪移植存活率影响的相关研究。因此,本课题通过三个部分进行研究。首先筛选出自噬调控药物处理ADSCs的最适浓度和处理时间,然后在体外实验中研究调控ADSCs自噬水平对其相关生物学活性的影响,最后在裸鼠脂肪移植模型中观察调控自噬后的ADSCs与颗粒脂肪混合移植后,最终移植物的存活率及相关组织学的改变情况。拟探讨调控自噬水平影响ADSCs生物学特性和旁分泌功能的相关机制,为调控ADSCs自噬对自体脂肪移植效率最终的影响提供可能的理论依据。研究目的:1.对比不同浓度梯度的雷帕霉素诱导ADSCs一天或七天,最终自噬的上调水平是否存在差异,以筛选出自噬调控药物处理ADSCs的最适浓度和处理时间。2.在体外实验中应用雷帕霉素和三甲基腺嘌呤（3-MA）分别促进和抑制ADSCs自噬,探讨调控自噬对细胞凋亡、成脂分化、增殖及衰老等生物学特性的影响及其相关的分子机制。3.在裸鼠脂肪移植模型中探讨雷帕霉素及3-MA预处理的ADSCs与自体颗粒脂肪混合移植后,移植物体积质量保留率的变化以及移植物自噬、凋亡、成脂、衰老和血管生成等方面的改变情况及其相关的分子机制。研究方法:第一部分:应用健康年轻女性患者腹部抽吸的脂肪按标准流程提取ADSCs并鉴定后进行体外培养,传至第三代后分别使用浓度为10nM、25nM、50nM、75nM及100nM的雷帕霉素处理ADSCs一天或七天。通过自噬蛋白LC3（microtubule-associated protein 1-lightchain3,微管相关蛋白 1-轻链 3）的免疫荧光染色半定量观察各组ADSCs的自噬水平变化,研究雷帕霉素浓度与ADSCs自噬水平之间的相关性,以及诱导时间对ADSCs自噬水平的影响。最终筛选出我院实验室条件下的最佳处理浓度及诱导时间。第二部分:本部分为体外细胞学实验,共分为四组:实验组为按照第一部分筛选出的雷帕霉素浓度及时间对ADSCs进行预处理的上调自噬组;阴性对照组为应用自噬抑制剂三甲基腺嘌呤预处理ADSCs的下调自噬组;设立雷帕霉素预处理上调ADSCs自噬后再用三甲基腺嘌呤预处理抑制自噬的混合处理组,通过将上调的自噬再次抑制后观察ADSCs各生物学特性的改变以验证这些变化是否为自噬介导的;未处理的正常ADSCs作为空白对照组。预处理后首先检测各组ADSCs的自噬水平变化,包括自噬基因ATG5/7/12的RT-PCR检测,自噬标记蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ和p62的Western blot（WB）检测。然后对各组ADSCs的生物学特性分别进行检测:包括对ADSCs的凋亡进行TUNEL染色、BAX基因的PCR检测和Caspase-3蛋白的WB检测;对ADSCs的成脂分化进行PPAR-γ基因的PCR和油红O染色检测;对ADSCs的细胞增殖情况进行CCK8检测;对ADSCs的细胞衰老进行P16/19/21基因的PCR及Sa-β-gal染色检测。此外,对ADSCs自噬、凋亡及成脂的检测还在氧糖剥夺（OGD）条件下重复以模拟移植早期体内缺血缺氧的环境的影响。第三部分:本部分为体内动物学实验,建立BALB/c裸鼠脂肪移植模型并将注射的脂肪分为4组:雷帕霉素预处理后的ADSCs悬液、3-MA预处理后的ADSCs悬液和未处理的ADSCs悬液（浓度均约为3.2X 106个细胞/ml）与颗粒脂肪以1:19的体积比混合,分别作为实验组、阴性对照组和正常对照组;生理盐水与颗粒脂肪（1:19）混合作为空白对照组。每组将0.2ml的混合脂肪皮下注射到24只裸鼠的双侧肩部及背部,每只裸鼠应用顺时针注射法注射4个位点以消除个体及注射位置不同可能带来的差异。在移植后的1、4、12周,取材（n=96）后计算体积和质量保留率;并检测ATG5/7/12、LC3 II/I、p62、BAX、Caspase-3、PPAR-γ、P16/19/21和VEGFA等基因和蛋白的表达水平;同时进行TUNEL、CD31和Perilipin免疫组化染色,评估各组脂肪移植物的具体组织学变化。研究结果:第一部分:LC3免疫荧光半定量结果显示10-100nM浓度的雷帕霉素对ADSCs的自噬均有促进作用,但不同浓度的雷帕霉素处理后各组ADSCs的LC3免疫荧光强度无明显差异（P>0.05）。在诱导时间方面,雷帕霉素诱导7天的LC3荧光强度高于1天（P<0.05）。此外,OGD条件会进一步增强ADSCs的LC3荧光强度,说明OGD与雷帕霉素的自噬诱导作用是可以叠加的。考虑到雷帕霉素的副作为剂量依赖性,因此选择荧光强度满意且文献使用最多的10nM作为雷帕霉素的处理浓度,选择7天作为诱导时间。第二部分:在正常和OGD条件下,雷帕霉素和3-MA预处理能分别上调和下调ADSCs的自噬水平。在正常条件下,随着自噬的上调ADSCs的细胞凋亡和衰老明显减少,成脂分化能力增强,而3-MA下调反之,但雷帕霉素和3-MA预处理对ADSCs的增殖均有一定的抑制作用。此外,在OGD条件下ADSCs的基础自噬和细胞凋亡水平均明显升高,同时成脂能力有所降低,此时上调自噬仍能有效减少ADSCs凋亡并促进其成脂分化,反之亦然。第三部分:在第1、4、12周取材时,雷帕霉素预处理组移植物的体积和质量保留率明显高于正常对照组,3-MA组略低于正常对照组且保留率与盐水组相似。雷帕霉素组移植物的自噬水平升高且组织凋亡、衰老减少,成脂更加活跃,3-MA组反之。但是体内实验中各组移植物间的生物学特性改变趋势没有体外实验显著。TUNEL,CD31及Perilipin等组织学染色的结果也显示上调ADSCs自噬后,组织凋亡明显减少,血管生成及脂肪生成有所提高,抑制自噬反之,这可能是雷帕霉素组体积和质量保留率提高的主要原因。结论:10nM雷帕霉素预处理7天的方法能有效激活ADSCs的自噬。在体外实验中上调ADSCs自噬后,细胞凋亡明显减少,成脂分化能力增强,细胞衰老延缓;3-MA下调自噬反之。并且上调自噬后ADSCs上述生物学特性的改变可再次被3-MA部分抑制,表明这些变化可能是通过调控自噬介导的。此外,在动物模型中将雷帕霉素预处理上调自噬的ADSCs与颗粒脂肪混合移植后,1、4、12周时移植物的组织凋亡减少、成脂更加活跃,血管生成增加,最终移植物的体积质量保留率也有所增加。因此,在联合ADSCs的脂肪移植过程中提高ADSCs的自噬水平可能是提高最终脂肪移植效率的一种可行的方法。