研究背景先天性小耳畸形是整形外科常见的疾病,尤其在亚裔人种中发病率较高。目前解决先天性小耳畸形的最好办法仍是自体肋软骨移植耳廓再造术,但该手术尚存在诸多问题,如肋软骨供区胸廓畸形,再造耳廓形态不理想等。组织工程的发展为软骨移植开辟了新的道路,体外利用软骨细胞制造具有耳廓形态的软骨结构早已可以实现,但组织工程耳廓的力学强度、柔韧性和灵活性仍与天然耳廓存在较大差距。天然耳软骨的活动度和韧性在很大程度上与软骨膜的存在有关,尽管软骨膜在多大程度上对耳廓软骨的力学强度起到助益作用尚未有研究证实。若能在组织工程软骨的表面附着一层类软骨膜结构,上述问题将有可能得到解决。目前对人工制作类软骨膜的研究很少,仅有的研究仅限于用化学聚合物材料膨胀模拟或使用动物冻干软骨膜贴附等,若能利用组织工程的方法构建软骨膜并实现与组织工程软骨的一体化构建,将对软骨组织工程的发展和应用产生深远影响。研究目的1.针对天然耳廓软骨在有无软骨膜附着时力学特性的变化展开探讨,研究软骨膜对耳廓软骨在生物力学特性上的影响,为本课题后续实验和今后的耳廓软骨力学研究提供理论基础;2.尝试使用不同的组织工程方法构建复合软骨膜的组织工程软骨,分析各种方法构建所得软骨在组织学、分子生物学、生物力学上的差异,探索构建复合软骨的可能性与研究价值;3.利用单细胞转录组测序技术对软骨膜细胞进行细胞聚类和亚群分析,探讨软骨膜中细胞成分,明确软骨膜中干/祖细胞的存在并研究其基因表达和应用潜力。研究方法1.软骨膜对耳廓软骨力学影响的研究取兔耳廓软骨制作力学试件,实验组保留软骨膜,对照组剥除软骨膜。使用Instron 5967万用材料试验机对两组软骨进行拉伸和压缩的应力-应变试验、拉伸和压缩的应力松弛试验以及拉伸蠕变试验,分析测试数据比较两组软骨的材料硬度、粘弹性等力学特征上的差异。2.构建复合软骨膜的组织工程软骨2.1.利用细胞膜片技术构建复合软骨膜的组织工程软骨获取和培养猪耳廓软骨细胞及软骨膜细胞,体外传代培养至P2代后,分别诱导制备软骨细胞细胞膜片和软骨膜细胞细胞膜片。细胞膜片培养成熟后,对照组将软骨细胞膜片折叠塑型为1 cm×1 cm的正方形软骨块,实验组在此基础上在软骨块上下两侧各包裹2层软骨膜细胞膜片。两组构建体体外孵育成熟后移植至裸鼠皮下,分别于4、8、12周后取材进行大体与组织学、相关基因表达、生物力学检测。2.2.利用3D生物打印技术构建复合软骨膜的组织工程软骨获取和培养猪耳廓软骨细胞和软骨膜细胞,体外传代培养至P2代后,将细胞与水凝胶材料混合配置生物打印墨水。实验组使用3D-Bioplotter生物打印机打印“软骨膜-软骨-软骨膜”三层复合结构,其中,软骨膜层使用软骨膜细胞与10%GelMA配置墨水打印,软骨层使用软骨细胞与10%GelMA+1%HAMA配置墨水打印;对照组仅按同样墨水配比打印软骨层。两组构建体打印完成后于细胞培养基中孵育过夜,次日移植至裸鼠皮下,于4、8、12周后取材大体与组织学、相关基因表达、生物力学检测。3.基于单细胞转录组测序技术对软骨膜细胞的亚群分析获取猪耳廓软骨膜细胞,制备细胞悬液,检测软骨膜细胞样本的质量与活性后对其进行单细胞转录组测序。测序后的数据经过生物信息学分析,根据软骨膜细胞整体高表达基因种类判断细胞主要成分。将软骨膜细胞进行重聚类分群,根据特异性表达基因确定软骨干/祖细胞的存在和细胞数量占比。对各个Cluster细胞的top 50差异高表达基因进行富集分析,明确各个细胞组分的功能。研究结果1.兔耳廓软骨在剥除软骨膜后力学特性在各个方面会出现明显的下降。拉伸试验中,剥除软骨膜后软骨杨氏模量下降约23%,压缩试验中,剥除软骨膜后软骨杨氏模量下降约37%。在应力-应变、应力松弛、蠕变等各项生物力学测试中,有膜组软骨均比无膜组软骨在力学特性上更优越。2.利用细胞膜片技术和3D生物打印技术均可以构建出“软骨膜-软骨-软骨膜”复合组织工程软骨,但构建出的软骨膜与天然软骨膜在大体、组织学上有显著差异。在生物力学上,有膜组构建软骨与无膜组构建软骨无统计学差异。然而,两种方法构建出的有膜组软骨构建体在成软骨程度上均优于无膜组软骨构建体,软骨膜的构建显著促进了软骨的形成。3.利用单细胞转录组测序技术对软骨膜细胞进行测序分析后,发现软骨膜细胞以间充质干细胞为主。本研究将软骨膜细胞分为7个亚群。其中,亚群6占细胞总数的5%,根据GO富集与KEGG富集结果,亚群6功能如软骨发育、胶原纤维组织管理、蛋白聚糖生物合成过程、软骨凝聚等与软骨组织形成密切相关,该群特异性表达软骨形成相关基因COMP,ACAN,ELN,ECM2等,在功能和基因表达上与软骨干/祖细胞高度吻合。总结软骨膜在维持耳廓软骨韧性、弹性和整体力学强度水平上发挥着重要作用,组织工程方法构建复合软骨膜的组织工程软骨有着重要意义。获取足量软骨膜细胞后,利用细胞膜片技术和3D生物打印技术可以构建复合软骨膜的组织工程软骨。复合软骨构建体在成软骨性能上显著优于单纯软骨,通过对软骨膜细胞进行单细胞转录组测序,可以发现软骨膜细胞成分的复杂性,并可以找到一群软骨干/祖细胞,这些细胞对软骨的发育和形成有明显的促进作用。不过,本研究基于目前水平构建的软骨膜在形态学和组织学上与天然软骨膜存在较大差距,在力学特性上无法对软骨起到类似于天然软骨膜的助益作用。