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慢性排斥反应(chronic rejection,CR)是影响移植病人远期生存的重要因素,且尚无早期临床和病理诊断的方法。iTRAQ标记的液相色谱质谱联用(iTRAQ-LC-MS/MS)联合生物信息分析软件系统(Ingenuity PathwaysAnalysis,IPA)的使用,是寻找差异蛋白、筛选蛋白分子标志物的理想工具。本研究在建立大鼠肝移植慢性排斥反应模型基础上,利用iTRAQ和IPA技术筛选肝移植慢性排斥反应的差异蛋白,探讨慢性排斥反应的可能发生机制以及诊断、治疗的新靶点。目的建立大鼠肝移植慢性排斥反应模型,利用iTRAQ和IPA技术筛选相关差异蛋白,旨在探讨慢性排斥反应诊断、治疗的新靶点和可能的发病机制。方法1.优化建立大鼠原位肝移植慢性排斥反应模型:SD→Lewis大鼠肝移植分2种组合:A组CsA联合氢化可的松干预;B组CsA、氢化可的松及硫唑嘌呤三联干预。每组合30例。分别于术后30、60、90和120d各随机处死5只,观察肝脏病理和外周血ALT和TBIL改变。各组除技术死亡的受鼠外,将余受鼠留做生存分析。2.以SD-Lewis大鼠肝移植慢性排斥反应模型为实验组(n=20),SD-SD大鼠肝移植模型对照组:(n=20),术后120d实验组和对照组各处死8只受体鼠,收集肝组织用于慢排反应病理学观察:将肝组织样本进行HE染色和特殊染色,光镜下观察移植肝汇管区炎症、胆管炎症损伤、阻塞性动脉病变以及肝组织纤维化。3.收集肝组织,利用iTRAQ标记技术(同位素标记相对和绝对定量技术)的定量蛋白质组学技术和方法,通过对实验组与对照组的蛋白表达量进行比较,筛选出差异1.5倍以上(上调或下调)的差异蛋白。4.应用生物信息学技术和软件IPA分析所有蛋白的细胞定位、细胞功能以及参与的细胞信号通路,并根据此类信息分析筛选出初步的、有意义的特征差异蛋白。应用IPA分析这些差异蛋白参与的调控网络和信号通路。5.利用Real-time PCR、Western Blot及免疫组化方法验证差异蛋白的表达,进一步筛选与肝移植慢性排斥反应相关的生物标志物。结果1.肝移植各主要操作步骤时间:热缺血时间<1min,供体手术20.0±1.5min,供肝修整3.5±1.5min,肝上下腔静脉吻合8±1.5min,门静脉重建2.5±1.0min,无肝期<15min,肝下下腔静脉重建3±1.0min。A组(SD→Lewis,CsA1.0mg/kg/d+氢化可的松0.75mg/kg/d)术后生存时间较B组(SD→Lewis,CsA1.0mg/kg/d+氢化可的松0.75mg/kg/d+Aza2mg/kg/d)明显缩短。120d时,绝大多数A组受鼠出现典型慢性排斥反应改变,肝脏缩小,质硬,呈结节状,病理染色表现为:肝小叶结构不完整,肝组织显著纤维化,纤维间隔形成;汇管区胆管破坏,胆管消失;动脉及其分支管壁炎症性增厚,管腔缩小≥50%或完全闭塞;CRAI评分≥9分。A组慢排反应较B组明显。2.应用iTRAQ联合液相色谱串联质谱(iTRAQ-LC-MS/MS)技术,对慢排实验组(SD-Lewis)和对照组(SD-SD)进行定量比较蛋白质组学研究,筛查与慢性排斥反应相关的差异蛋白。质谱鉴定总共得到24328条独特肽段,对应1056个非冗余蛋白质,设定差异1.5倍以上(上调或下调)的蛋白认为有意义,结果显示有62个蛋白质为肝移植术后慢性排斥反应相关的差异蛋白质,其中32个蛋白表达上调,30个蛋白表达下调。3.经IPA数据库(Ingenuity Knowledge Base,Genes Only)的统计分析,共参与3个主要的通路网络(参与网络的蛋白超过15个)。其中脂质代谢/分子转运/小分子生物化学网络中涉及蛋白23种,免疫系统疾病/皮肤疾病/结缔组织疾病的功能网络中涉及蛋白22种,而有15种蛋白则参与组成翻译后蛋白修饰/蛋白质折叠/遗传疾病的功能网络。另外Gene oncology功能分析显示差异蛋白质相互作用网络涉及多条信号通路中的调控因子,包括:Methionine salvage pathway、AMPK通路、mTOR通路以及Granzyme A途径。4.选取6种蛋白进行Q-PCR及免疫组化验证。与同品系对照组比较,Q-PCR结果显示慢排组中Lcn2蛋白所对应的基因表达上调(P<0.05),Krt19蛋白所对应的基因表达下调(P<0.05)。免疫组化显示慢排组织中Lcn2阳性表达率明显高于对照组肝组织,两组之间相比有差异(P<0.05)。慢排组织中Krt19明显低表达(P<0.05)。Lcn2和Krt19蛋白的表达情况与iTRAQ结果高度一致。5. Western blot检测慢排反应不同时间段(术后60d,90d,120d)Lcn2及Krt19蛋白的表达。Lcn2蛋白随着慢性排斥反应程度加重表达量增加,而Krt19蛋白随着慢性排斥反应程度加重表达量减少。结论1.SD→Lewis (CsA1.0mg/kg/d+氢化可的松0.75mg/kg/d)组合的大鼠原位肝移植术后肝脏病理改变、肝功能的变化及生存时间均符合临床上肝移植术后慢性排斥反应的特点,稳定可靠,可重复性好,是研究肝移植慢性排斥反应理想的动物模型。2.iTRAQ-LC-MS/MS新技术具有易于操作、重复性好、快速、直观、高通量观察蛋白变化的特点,可应用于寻找与慢性排斥反应相关的差异蛋白,适于肝移植慢性排斥反应的基础研究。3.IPA技术及GO分析可进一步寻找与分析肝移植慢性排斥反应相关的差异蛋白分子,并寻找其相互作用的网络信号通路,为肝移植术后慢性排斥反应的预测和治疗提供潜在的靶点和理论依据。4.Lcn2及Krt19蛋白表达与慢性排斥反应程度呈相关性改变,可能可作为早期预测慢性排斥反应的生物学标记物,以及潜在的诊疗靶点。