马铃薯Y病毒科-Potyviridae是第一大植物RNA病毒科,该科病毒危害多种重要的经济作物和粮食作物。Potyviridae病毒基因组N端编码的前导蛋白酶高度变异,在病毒侵染过程中具有重要的生物学意义。课题组前期从海南槟榔中鉴定出两种新病毒,即槟榔坏死环斑病毒（ANRSV）和槟榔坏死梭斑病毒（ANSSV）,基因组注释和序列分析表明:ANSSV和ANRSV在分类上归属于Potyviridae的一个新属-槟榔病毒属（Arepavirus）。不同于Potyviridae其他病毒,生物信息学分析预测ANSSV和ANRSV编码特异的前导蛋白酶,即串联的半胱氨酸蛋白酶（HCPro1-HCPro2）。为了解析ANSSV编码的HCPro1-HCPro2在病毒侵染过程中的生物学功能,本文开展了以下研究:1.ANSSV基因组N端编码特异串联的前导半胱氨酸蛋白酶:本研究利用麦胚体外翻译系统证实了 ANSSV基因组的N端编码串联的、具有顺式切割活性的半胱氨酸蛋白酶（HCPro1-HCPro2）,并且明确了两者的蛋白酶催化活性位点,分别是C161和C463。随后我们构建了 HCPro1和HCPro2预测切割位点的丙氨酸代替突变体,体外翻译试验明确了 HCPro1和HCPro2的切割位点,分别是273G/S274和574G/G575,从而界定了两者在ANSSV基因组中的确切位置。2.HCPro1和HCPro2在抵御宿主RNAi介导的抗病毒免疫反应中的功能分化:Potyviridae病毒编码的HCPro之间的同源性较低,为深入探究HCPro1-HCPro2的功能,我们对potyviral HCPro的序列特性进行分析。结果表明potyviral HCPro包含变异程度较高的N端区域和相对保守的半胱氨酸蛋白酶区域。Potyviridae病毒编码的前导蛋白酶具有抵御宿主RNAi介导的抗病毒免疫反应的功能,而且Potyvirus病毒编码的HCPro是基因沉默抑制子。因此,我们通过农杆菌介导的共表达体系证实HCPro1和HCPro2在抵御寄主RNAi防御反应中的功能,结果表明:HCPro2是基因沉默抑制子,HCPro1不具有该功能。与其他potyviral HCPro不同的是,HCPro2抑制基因沉默活性不受上游蛋白酶HCPro1酶切活性的影响。此外,HCPro2的N端区域和蛋白酶结构域都能独立行使抑制寄主防御反应的功能。有趣的是,HCPro1高度变异的N区具有抑制基因沉默活性,反而相对保守的蛋白酶结构域不能抑制基因沉默,进而导致HCPro1丧失抑制基因沉默的功能。3.ANSSV反向遗传学体系的建立:构建ANSSV基因组全长的cDNA克隆（pSS-Ⅰ）,而且此克隆能够成功侵染宿主-本氏烟。随后,我们在pSS-Ⅰ克隆的NIb/CP接合处整合完整GFP编码序列,获得GFP标记的ANSSV克隆（pSS-I-G）,且pSS-I-G具有侵染活性。4.HCPro1-HCPro2在病毒侵染过程中的功能研究:为解析HCPro1和HCPro2在病毒侵染过程中的生物学意义,我们以克隆pSS-I-G为基础,分别构建了删去HCPro1和HCPro2的突变克隆,侵染性测定结果表明两者的缺失致使病毒丧失侵染活性。随后,我们构建了 TuMV的P1和HCPro分别替代HCPro1和HCPro2,以及P1-HCPro和HCPro1-HCPro2相互交换的杂合病毒克隆,侵染性测定结果表明:以上克隆均丧失侵染本氏烟的能力。因此,HCPro1和HCPro2对病毒的侵染至关重要,两者协同促进病毒的侵染。通过本研究,我们明确了 ANSSV基因组N端编码特异串联的前导半胱氨酸蛋白酶（HCPro1-HCPro2）,HCPro1和HCPro2能够差异抵御宿主RNAi介导的抗病毒免疫反应,而且两者协同维护病毒的融合侵染。此研究为下一步深入研究病毒与寄主的互作、病毒致病机制和病害防控等鉴定基础,也有利于我们对Potyviridae病毒基因组N端高度变异区的生物学功能多样性的理解。