猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)是一种无囊膜单股环状DNA病毒,可分为4个亚型,PCV1普遍认为无致病性,PCV2和PCV3与断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎与肾病综合征等多种疫病有关,PCV4是2019年在中国湖南省患病猪群中发现的。为了解河北省猪群中猪圆环病毒流行情况,本研究建立了PCV4实时荧光PCR方法,对河北省猪群中猪圆环病毒开展了流行病学调查,并对PCV4流行毒株进行遗传进化分析。1.参照Gen Bank收录的PCV4 ORF2基因保守序列,设计、合成1对特异性引物和1条Taq Man探针,优化反应体系,建立了PCV4实时荧光PCR方法。结果显示,该方法的Ct值与标准品在1.53×10~7～1.53×10~3copies/μL范围内呈良好线性关系,R~2为0.999;特异性强,仅对PCV4呈特异性扩增,与PCV1、PCV2、PCV3及多种猪常见病原均无交叉反应;敏感性高,最低检测限为1.53×10~1copies/反应;重复性好,组内、组间变异系数均小于2%。2.通过实时荧光PCR方法对2013～2020年间河北省11个地区的960份样本进行PCV检测。结果显示,PCV2、PCV3和PCV4阳性率分别为85.52%、25.52%和1.15%,且存在混合感染情况。不同时间PCV阳性率不同,2013年～2020年间PCV2阳性率逐年降低;PCV3在2017年检出率高达86.79%;PCV4仅在2019年检出,阳性率2.83%。不同地区PCV阳性率也不相同,各地PCV2阳性率均在70%以上,PCV4仅在衡水和石家庄样品中检出,阳性率分别为6.67%和1.33%。不同类型样品中PCV阳性率不同,PCV2和PCV3在淋巴结/脾脏/肺脏合样中阳性率最高,分别为99.58%和80.33%;PCV4在淋巴结中阳性率最高,为2.13%。3.选取部分PCV4阳性病料,扩增PCV4 ORF2基因和全基因组序列,测序后进行遗传进化分析。共获得3条PCV4 ORF2基因序列(Hebei-AP15-2019、Hebei-AP67-2019和Hebei-LS1-2019)和1条Hebei-AP-67-2019全基因组序列,上传至Gen Bank(登录号分别为MW439193、MT995847、MW439192和MW084633)。PCV4 ORF2基因序列与Gen Bank中11个国内代表毒株核苷酸及推导氨基酸同源性分别为98.5%～99.6%和98.7%～100%;全基因组序列与7个代表毒株的核苷酸同源性为98.8%～99.5%,河北株与我国其他省份PCV4毒株同处一个小分支,亲缘关系较近。