食源性致病菌及其生物膜是诱发食源性疾病的主要原因,严重威胁食品工业的发展和人类健康。致病菌存在的抗生素耐药性增加了人类感染的风险,给医疗行业带来了巨大的负担。细菌素是一类细菌核糖体合成的具有抗菌作用的多肽,被认为是天然的食品防腐剂和潜在的抗生素替代品。此外,由于对化学防腐剂安全性的担忧,消费者更倾向于选择天然防腐剂用以防控食源性致病菌污染。因此,迫切需要开发高效、安全的细菌素作为食品防腐剂和抗菌剂应用于食品和医药领域。基于实验室前期挖掘到的细菌素BMP32基因,本研究通过异源表达获得具有广谱抑菌活性的重组细菌素BMP32r,对其进行纯化和鉴定,研究其理化性质、抑菌活性、杀菌机制、抑制生物膜机制及对混合生物膜的抑制作用,并将其应用于食品和医药领域,以期为其应用奠定理论基础。具体研究内容和结果如下:（1）细菌素BMP32异源表达系统的构建及选择:基于面包乳杆菌MN047基因组扩增出细菌素BMP32基因,构建了p ET-30a（+）-BMP32重组质粒,将其转入大肠杆菌BL21;根据毕赤酵母密码子偏好性,合成细菌素BMP32编码基因序列,构建了p PIC9K-BMP32重组质粒,并将其转入毕赤酵母GS115。分别诱导表达后结果显示,两套表达系统均能实现目标细菌素的异源表达,原核表达系统制备细菌素样品对大肠杆菌指示菌的抑菌效价为320 AU/m L,而其在真核表达系统中的抑菌效价为20 AU/m L。结合原核表达系统表达周期短、目标样品活性高等优势,选择大肠杆菌表达系统作为细菌素BMP32的制备方式。（2）细菌素BMP32r的纯化、鉴定和理化性质:通过大肠杆菌表达系统制备携带有HIS标签的重组细菌素BMP32r,并对其进行纯化和鉴定;采用二倍稀释法测定其的最小抑菌浓度,并对BMP32r的稳定性和溶血活性进行测定。结果表明,建立的Ni-NTA亲和层析柱和高效液相色谱结合的两步纯化方案能有效的纯化细菌素BMP32r,LC-MS/MS鉴定到细菌素BMP32r的表达,纯化后的细菌素BMP32r对大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC 25923的最小抑菌浓度分别为9.2 mg/L和18.4 mg/L,具有较好的抑菌活性。该细菌素具有良好的热稳定性、p H稳定性、贮藏稳定性和化学试剂稳定性。此外,细菌素BMP32r在0-147.2 mg/L浓度条件下具有低的溶血活性。（3）细菌素BMP32r的抑菌活性及抑菌机制:采用琼脂扩散法测定细菌素BMP32r的抑菌谱;通过生长曲线和杀菌曲线测定其抑菌和杀菌作用;利用扫描电镜和透射电镜观测细菌素BMP32r处理对指示菌（大肠杆菌和金黄色葡萄球菌）微观结构的影响,通过碘化丙啶吸收和乳酸脱氢酶释放试验测定细菌素BMP32r对指示菌细胞膜的损伤。结果表明,细菌素BMP32r具有广谱抑菌活性,能抑制多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌,其中包括一些多重耐药菌;能有效抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长,具有杀菌作用;细菌素BMP32r造成大肠杆菌细胞表面碎片,结构断裂,内部质壁分离,胞内物质分布不均匀,甚至造成细胞裂解;能引发金黄色葡萄球菌表面凹陷,内部质壁分离,胞内物质分布不均匀的现象。此外,细菌素BMP32r处理增加指示菌碘化丙啶摄取和胞外乳酸脱氢酶的含量。这些结果说明,细菌素BMP32r通过破坏细胞膜完整性,诱导胞内物质流失,甚至裂解细胞的方式诱导细菌死亡。（4）细菌素BMP32r抑制单增李斯特菌生物膜的作用机制:采用二倍稀释法测定细菌素BMP32r对单增李斯特菌的最小抑菌浓度;通过生长曲线和杀菌曲线测定其亚抑菌浓度、对浮游菌的抑制和杀死作用;利用结晶紫染色、CCK-8、平板计数法、半固体平板、钌红染色、实时定量PCR和扫描电镜探究亚抑菌浓度细菌素BMP32r对单增李斯特菌生物膜的抑制作用;通过结晶紫染色、CCK-8和平板计数法评价细菌素BMP32r对成熟单增李斯特菌生物膜的破坏作用;采用平板计数法测定细菌素BMP32r对单增李斯特菌顽固菌的杀死作用。结果表明,细菌素BMP32r对单增李斯特菌的最小抑菌浓度为4.6 mg/L。在4×MIC浓度条件下处理3 h能完全杀死单增李斯特浮游菌。亚抑菌浓度（1/16×MIC和1/32×MIC）的BMP32r几乎不影响单增李斯特菌的生长,但可以降低单增李斯特菌生物膜的形成量,减少生物膜内菌的数目,抑制细菌的泳动,减少胞外多糖的分泌,下调群体感应和毒力基因的表达。浓度为2×MIC和4×MIC的细菌素BMP32r能减少成熟生物膜的形成量,杀死生物膜内菌,破坏生物膜结构。4×MIC的细菌素BMP32r能在4 h内完全杀死单增李斯特顽固菌。这些结果说明,细菌素BMP32r能通过杀死浮游菌、减少生物膜形成、破坏成熟生物膜和杀死顽固菌等多个方面抑制单增李斯特菌生物膜。（5）细菌素BMP32r对混合生物膜的抑制作用:通过结晶紫染色和CCK-8测定混合生物膜的形成规律;采用结晶紫染色、平板计数法和银染法探索细菌素BMP32r对混合生物膜的抑制作用;采用平板计数法测定细菌素BMP32r对成熟混合生物膜的破坏作用。结果表明,大肠杆菌的添加降低混合生物膜的形成量及生物膜内菌的代谢活力,而金黄色葡萄球菌的添加有助于混合生物膜的形成并增加生物膜内菌的代谢活力。细菌素BMP32r处理能显著降低混合生物膜的生成量和粘附菌数目,光学显微图像显示,细菌素BMP32r能降低混合生物膜内菌的聚集和胞外物质生成。此外,细菌素BMP32r能有效破坏成熟的混合生物膜,但单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌形成的混合生物膜对BMP32r的耐受性较高。这些结果说明,细菌素BMP32r能有效的抑制混合生物膜的形成、破坏成熟的混合生物膜,但对于单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌形成的混合生物膜抑制效率降低。（6）细菌素BMP32r在食品及医药方面的应用:采用平板计数法分别测定细菌素BMP32r对牛奶中单增李斯特菌的杀死作用及对食品级材料基质上生物膜形成的抑制作用探索其在食品领域的应用潜力;利用HFF细胞增殖试验测定细菌素BMP32的细胞毒性,采用小鼠皮肤伤口耐药菌感染模型开发其在医药领域的应用。结果表明,在贮藏期内,细菌素BMP32r能有效抑制牛奶中单增李斯特菌的生长,4×MIC的BMP32r在第一天就能完全杀死牛奶中单增李斯特菌且没有出现再次生长的现象。单增李斯特菌生物膜的形成受到温度和粘附材料的影响,在25℃条件下的形成量大于4℃条件下的形成量,在粘附材料上的生物膜形成量为硅胶表面>不锈钢表面>玻璃表面。细菌素BMP32r处理能有效降低生物膜的形成量。此外,细菌素BMP32r可以通过杀死小鼠伤口感染的多重耐药菌促进小鼠皮肤伤口愈合。细菌素BMP32r对HFF细胞具有较低的细胞毒性,即使高浓度（200 mg/L）的细菌素对小鼠主要器官也无明显的损伤,细菌素BMP32r具有一定的生物安全性。这些结果说明,细菌素BMP32r有潜力开发为食品防腐剂和抗菌剂应用于食品和医疗领域。