酒酒球菌（Oenococcus oeni）是葡萄酒发酵过程中应用最多的一类乳酸菌,除了可以降低葡萄酒的酸度外,其所产的β-葡萄糖苷酶还可以将葡萄酒中糖苷键合态的香气化合物转化为游离态的香气物质而显著提升葡萄酒的香气水平。作为一种纤维素酶,β-葡萄糖苷酶广泛应用于生物质能源转化、食品和医疗等领域,目前,研究人员己对微生物来源的β-葡萄糖苷酶作了大量研究,但这些β-葡萄糖苷酶主要是来源于黑曲霉和酵母菌,而对于酒酒球菌来源的β-葡萄糖苷酶的研究较少,关于其所产β-葡萄糖苷酶的酶学性质和催化机理也缺乏必要的阐释。因此,为深入了解和阐释酒酒球菌β-葡萄糖苷酶的酶学性质和催化机理,本论文首先对酒酒球菌来源的β-葡萄糖苷酶进行了同源分析;其次,通过基因克隆和异源表达技术分离得到了来自酒酒球菌SD-2a的重组β-葡萄糖苷酶BGL0224,并研究了该重组酶的酶学性质、结构和催化机理;此外,以商业β-葡萄糖苷酶作为对比,分析了重组β-葡萄糖苷酶BGL0224对赤霞珠葡萄酒品质特性的影响。主要研究结果如下:（1）酒酒球菌β-葡萄糖苷酶的同源分析。通过筛选得到了来自酒酒球菌的35个β-葡萄糖苷酶,这些β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列长度在129～752之间,等电点在4.84～9.30之间,相对分子质量在15 k Da～84 k Da之间。35个β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列中共检索到了6个不同的保守结构域,出现最多的是Bgl B保守结构域。35个β-葡萄糖苷酶被分为3个进化分支,不同分支之间β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列长度和Motif组成不同。分支I和II中的β-葡萄糖苷酶属于GH1家族,而分支III中的β-葡萄糖苷酶则属于GH3家族。（2）酒酒球菌SD-2a中β-葡萄糖苷酶的异源表达和纯化。酒酒球菌SD-2a中有三个编码β-葡萄糖苷酶的基因被成功克隆,分别是OEOE-1569、OEOE-1210和OEOE-0224。相较于p ET-28a,表达质粒Pcold I更适合表达酒酒球菌SD-2a中的β-葡萄糖苷酶基因。Pcold I质粒不仅可以成功表达所有的三个β-葡萄糖苷酶基因,而且其对OEOE-0224和OEOE-1210两个基因的表达还避免了包涵体的困扰。重组β-葡萄糖苷酶BGL0224活性显著高于BGL1569和BGL1210,通过对重组酶BGL0224的分离纯化,酶的比活力达到5.92μkat/mg,纯度提高了147.98倍,回收率为14.58%。LC-MS/MS结果表明BGL0224的相对分子质量为55151.84 Da,等电点为6.14。（3）重组酶BGL0224的酶学性质表征。重组酶BGL0224由480个氨基酸残基组成,属于糖苷水解酶第一家族,为细胞内的亲水性蛋白,且不含信号肽。重组酶BGL0224的最适反应温度为50℃,最适反应p H为5.0,热稳定性和p H稳定性良好;0～20%的乙醇浓度对酶活有显著的促进作用,尤其当乙醇浓度为12%时促进作用最强;K+,Na+和Hg+对重组酶BGL0224的活性基本没有影响,Ba2+和Li+对酶活略有促进作用,其余金属离子和添加剂对酶活均有抑制作用,尤其是Triton-X100和Tween-80,对酶活性的抑制作用超过了80%。重组酶BGL0224在260～280 nm处有标准紫外吸收峰;当激发波长为339 nm时,该酶在440 nm处有最大荧光发射波长;该酶的化学结构中四种化学键的运动强烈,分别是O-H键、N-H键、C=C键和C-O键;该酶化学结构中碳原子的化学位移值在30 ppm至160 ppm之间,氢原子的化学位移值在0.03 ppm到10.25ppm之间。重组酶BGL0224催化标准底物p-NPG的Vmax值为382.81±7.76μM/min/mg,Km值为0.34±0.04 m M,Kcat值为351.88 S-1,Kcat/Km值为1034.94 S-1?μM-1。（4）重组酶BGL0224的催化机理探究。重组酶BGL0224对七种底物均有一定的催化作用,除作用于对硝基苯基β-D-吡喃葡糖醛酸苷和对硝基苯基β-D吡喃木糖苷的最适反应温度分别为45℃和40℃外,催化其余5种底物时的最适反应温度均为50℃,重组酶BGL0224催化七种底物的最适反应p H均为5.0。该重组酶催化对硝基苯基β-D吡喃葡萄糖苷、对硝基苯基β-D吡喃半乳糖苷、对硝基苯基β-D吡喃木糖苷、对硝基苯基β-D纤维二糖苷、对硝基苯基β-D-吡喃葡糖醛酸苷、对硝基苯基α-D吡喃葡萄糖苷和对硝基苯基α-D吡喃半乳糖苷七种底物的Km分别为:0.34、0.95、1.10、0.43、1.87、1.42、1.70 m M,Vmax分别为:382.81、270.88、256.43、359.54、24.17、39.27、39.64μM/min/mg,Kcat/Km分别为:1034.94、262.09、214.28、768.58、11.88、25.42、21.43 S-1?μM-1,活化能Ea分别为:23.70、28.72、34.26、25.83、76.96、67.09、73.89 k J/mol。七种底物对重组酶BGL0224蛋白基团的荧光猝灭机制均为静态猝灭,猝灭常数Kq分别为8.07、5.25、4.93、7.51、0.93、1.10、0.78×1012 L?M-1,结合常数Kb分别为:8.09、4.53、3.94、7.62、0.73、0.83、0.73×104 L?M-1。以β-葡萄糖苷酶Bgl A的晶体结构为模板构建了BGL0224的三维结构模型,模型符合立体化学的能量规律。分子动力学模拟结果表明复合物体系“BGL0224-p NPG”在40 ns后趋于稳定,体系的结合能为-202.00±20.72k J/mol。氢键和π-π相互作用是重组酶BGL0224与底物p-NPG结合过程中的重要驱动力,二者之间的相互作用遵循双位移反应机制,谷氨酸残基Glu178和Glu377在整个催化过程中起着至关重要的作用。（5）重组酶BGL0224对赤霞珠葡萄酒品质特性的影响。主成分分析中两个主成分的方差之和占总方差的80.20%,说明电子鼻可以很好的区分经过不同处理的赤霞珠葡萄酒。在酒精发酵之前添加重组β-葡萄糖苷酶BGL0224可以显著提升赤霞珠葡萄酒的“芳香指数”。在所有的酒样中一共检测到了78种香气化合物,其中CK组、A1组、A2组、B1组和B2组酒样中分别检测到了47种、62种、63种、63种和49种香气化合物。在酒精发酵之前添加重组酶BGL0224可以显著增加赤霞珠葡萄酒中的中链脂肪酸乙酯、长链脂肪酸乙酯和萜烯类化合物的浓度,也提升了赤霞珠葡萄酒的“热带水果味”、“甜水果味”和“花香味”,同时抑制了“柑橘味”的感官特征。赤霞珠葡萄酒中的“热带水果味”与中链脂肪酸乙酯和长链脂肪酸乙酯呈正相关,与短链脂肪酸乙酯和其他酯类呈负相关;“花香味”与萜烯类化合物呈正相关,与短链脂肪酸乙酯和醇类化合物呈负相关。