鸡蛋清溶菌酶可以水解细菌和真菌细胞壁中的N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间形成的β-1,4-糖苷键，故对细菌及细胞壁具几丁质组分的真菌具有一定的溶菌作用。体外抑菌活性表明，鸡蛋清溶菌酶对棉花枯、黄萎病、细菌白叶枯病等有比较强的抑制作用，因而有望成为一个较好的抗病基因候选者。毕赤酵母是近年来发展非常迅速的一种外源蛋白表达宿主，因其易于操作、安全性高、遗传性状稳定、可把目标蛋白分泌到胞外、发酵原材料价格低廉、具有真核生物翻译后加工功能、可进行高密度发酵等优点等而受到人们的青睐。为验证重组鸡蛋清溶菌酶仍具有抑菌活性，我们采用毕赤酵母表达系统进行了组成型表达鸡蛋清溶菌酶的初步研究。对发酵液上清进行SDS-PAGE分析，发现密码子优化后的鸡蛋清溶菌酶能够在毕赤酵母中得到表达，表达量约为54mg/L；对发酵液上清进行抑溶壁小球菌（Micrococcus lysodeikticus）的实验，实验结果表明，在毕赤酵母中表达的重组鸡蛋清溶菌酶具有溶菌活性，并与天然的鸡蛋清溶菌酶活性近似。依据发酵液上清对溶壁小球菌产生的抑菌圈的大小，从多个酵母重组子中筛选出一株重组蛋白表达量比较高的毕赤酵母菌株pGAP9K-helh。将该重组子接种于50mL BMGY培养基中，经逐级放大，最后在50L发酵罐中发酵培养6d。发酵液经4℃、5000rpm离心10min，留取上清，然后再经纳滤处理并冷冻干燥，获得了重组鸡蛋清溶菌酶的粗提样品。利用该蛋白粗提样品对棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporium）以及黄萎病菌（Verticillium dahliae）进行体外抑菌试验，结果发现，毕赤酵母中表达的重组鸡蛋清溶菌酶对棉花的枯、黄萎病菌具有一定的抑制作用。农杆菌介导法转化植物的效率比较高，并且具有较高的遗传稳定性，此外，外源基因多以单拷贝或低拷贝方式插入受体的基因组中，且绝大多数转基因后代的遗传符合孟德尔规律，得到的转基因植株一般是可育的。鉴于上述理由，我们拟采用农杆菌介导法将鸡蛋清溶菌酶基因导入棉花，以期获得高抗棉花枯、黄萎病菌的转基因棉株。为了提高鸡蛋清溶菌酶基因在棉花中的表达水平，在构建表达载体时，在该基因的5′端添加了Kozak序列及大麦α-淀粉酶信号肽序列，在基因3′端添加Poly(A)序列，修饰后的基因被置于35S组成型启动子控制之下，最后得到植物表达载体pBI-35Shel。在该表达载体中，还同时插入了由质体蓝素启动子调控的CP4-EPSPs基因表达框，它不仅可作为报告基因，同时也赋予转基因棉花工程植株抗除草剂——草甘膦的能力。在农杆菌介导下，利用表达载体pBI-35Shel转化珂字312及R15。到目前为止，获得如下阶段性结果：1）R15为受体：从48块初生愈伤中，获得了25个line的胚性愈伤。从这25个line的胚性愈伤中，得到了19个line的再生植株。采用嫁接法嫁接试管苗，对嫁接成活的棉苗分别进行PCR和ELISA检测，结果发现，有4个line的16株棉苗表现为PCR阳性，其中有4株CP4-EPSPs高表达，其OD650约为阴性对照植株的10倍。2）以珂字312为受体：从31块初生愈伤中，获得了23个line的胚性愈伤，从这23个line的胚性愈伤中，得到了18个line的再生植株。同样对这批嫁接成活的棉苗进行PCR和ELISA检测，结果发现，有3个line的9株表现为PCR阳性，其中有3株CP4-EPSPs基因高表达。高表达阳性植株的抗病性工作有待于进一步鉴定。