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研究背景急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)及非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma, NHL)都是淋巴细胞起源恶性肿瘤,是儿童最常见的恶性肿瘤。近年来随着诊疗水平的提高,ALL的长期无病生存率可达70%,特别是低危型ALL甚至可达90%。NHL的预后与肿瘤类型及分期有很大关系。目前儿童NHL协作组中,5年无病生存率已达60-80%。Burkitt淋巴瘤(Burkitt lymphoma, BL)是一种浸润性很高的B细胞来源的恶性淋巴瘤,常规化疗疗效差,预后不良,需加强化疗才能提高疗效。由于肿瘤的耐药性,部分病人最终出现复发,导致治疗失败而死亡。虽然Burkitt淋巴瘤细胞对化疗极度敏感,但对于具预后不良特征的或复发的患者需发展生物学的靶向治疗。所有BL和部分ALL病人存在以下一种染色体异常：t(8；14)、t(2；8)、t(8；22),其共同特点是8q24的c-myc基因发生易位而导致c-myc基因高表达。这种克隆性异常与肿瘤的组织学类型、免疫分型、临床特征、治疗反应和预后等密切相关。研究表明,c-myc表达产物c-Myc蛋白具有促进DNA复制,调节细胞生长、增殖及分化等功能。c-myc基因表达失控在肿瘤发生、发展过程中起关键作用。t(8；14)是不良的预后因素,c-myc基因高表达是导致其表型特点的原因,其临床上常表现早期发生髓外浸润,常规化疗疗效差,预后不良,通常疾病进展迅速,是肿瘤发生原发耐药的重要原因。由于肿瘤的发生发展需要c-myc基因的持续表达,因此,可以设想抑制其表达可使肿瘤失去肿瘤表型。RNAi技术,即RNA干扰,又称为转录后基因沉默(post-transcriptional gene sciencing, PTGS),能特异性抑制基因表达,是一种转录后基因表达调控机制,是近年发展起来的一种快速关闭基因的新方法,目前已被广泛应用于功能基因组和基因治疗的研究。近年研究表明,RNAi具有高度序列特异性,可抑制相应靶基因表达。RNAi已经被开发成为反向遗传学的一个强有力的工具,并且显示出广阔的治疗学上的应用前景。淋巴细胞起源恶性肿瘤是儿童时期最常见的恶性肿瘤,也是导致病人死亡的主要疾病之一。尽管目前通过加强化疗及造血干细胞移植可使病人长期无病生存甚至治愈,但仍有部分病人因耐药而导致复发。因此如何能在现有诊疗水平基础上进一步提高治疗效果,是对临床工作者及科研工作者的迫切要求。Jiyoye细胞株是研究BL和ALL的典型细胞株,其c-myc基因从8号染色体易位到14号染色体,使c-myc基因被激活。本研究利用RNAi技术合成针对c-myc基因的小干扰RNA(siRNA),通过慢病毒载体介导转染给人Jiyoye细胞株,观察细胞c-myc mRNA和蛋白表达水平的变化,筛选出沉默效率最高的干扰序列pLVX-c-myc-3,并进一步体外转染Jiyoye细胞,评估c-myc表达下调对肿瘤细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响,以期为靶向c-myc基因的白血病和恶性淋巴瘤基因治疗提供实验依据。目的运用RNAi技术,探讨经慢病毒载体介导的si RNA对Jiyoye细胞c-myc基因mRNA及蛋白表达的抑制作用,并进一步转染Jiyoye细胞,评估c-myc表达下调对肿瘤细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响,以期为靶向c-myc基因的白血病和恶性淋巴瘤基因治疗提供体外实验依据。方法设计、合成三对针对c-myc基因的c-myc-1、c-myc-2和c-myc-3寡聚核苷酸链和一对阴性对照c-myc-neg寡聚核苷酸链。三条寡聚核苷酸链序列为：c-myc-1:5’-TCCGTACAGCCCTATTTCA-3’; c-myc-2:5’-TGGAGATGATGACCGAGTT-3’; c-myc-3:5’-GAGCAAGAAGATGAGGAAG-3’。设阴性对照c-myc-neg寡聚核苷酸链序列：5’-CGGCGCATAAGAAGCATAT-3’。退火,然后连接到pLVX干扰载体上,包装,慢病毒介导转染人Jiyoye细胞株。转染后培养72h,流式细胞术检测各组细胞转染率,采用real-time PCR和Western blot法检测各组细胞c-myc mRNA和蛋白表达水平的变化。pLVX-c-myc-3转染Jiyoye细胞,MTT法检测各组细胞增殖情况；PI单染流式细胞术检测细胞周期；Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡结果1.重组shRNA表达载体的PCR鉴定LVX载体经PCR反应后,均出现与预期大小相符的目的条带,载体pEGFP(阴性对照)无片段出现,表明重组shRNA表达载体pLVX-c-myc构建成功。2.流式细胞术鉴定各组转染效率转染72h后,采用流式细胞术鉴定各组的阳性细胞。c-myc-neg组阳性细胞比例为(54.3±4.2)%,平均荧光强度为5.98±0.41；c-myc-1组阳性细胞比例为(51.6±3.8)%,平均荧光强度为6.12±0.63；c-myc-2组阳性细胞比例为(53.7±3.3)%,平均荧光强度是6.04±0.37；c-myc-3组阳性细胞比例为(52.8±2.9)%,平均荧光强度是6.01±0.52。各组的阳性细胞率无明显差异(p>0.05),各组细胞平均荧光强度也无明显差异(p>0.05),表明各组细胞转染率无明显差异。3.Real-time PCR分析各组c-myc的mRNA表达情况转染72h后,real-time PCR法检测各组c-myc mRNA表达情况,以GAPDH做内参照,样品待测基因的值除以此样品内参的值,最终得到的比值为样品的待测基因相对含量。与转染阴性对照c-myc-neg组相比,转染c-myc-1、c-myc-2和c-myc-3组c-myc mRNA表达水平均有下调(p<0.05); c-myc-3组下降最为明显,和c-myc-1、c-myc-2相比差异显著(p<0.05),未转染组和转染阴性对照c-myc-neg组之间无明显差异(p>0.05)。表明pLVX-c-myc-3能下调c-myc基因mRNA的表达。4. Western blot分析各组c-Myc蛋白的表达情况转染72h后,Western blot方法检测各组c-Myc蛋白表达情况。与pLVX-c-myc-neg组相比,转染pLVX-c-myc-1组、pLVX-c-myc-2组和pLVX-c-myc-3组c-Myc蛋白表达均下降(p<0.05), pLVX-c-myc-3组下调最为明显(p<0.05)。表明pLVX-c-myc-3能特异性抑制c-myc基因的表达。5. pLVX-c-myc-3对Jiyoye细胞增殖的影响转染168小时生长曲线显示转染pLVX-c-myc实验组细胞生长缓慢,与阴性对照组和空白对照组比较,差异有显著性(p<0.05)。转染pLVX-c-myc 72 h后,采用MTT法检测细胞活力。实验组细胞抑制率为(46.40±1.41)%,阴性对照组细胞抑制率为(17.03±1.32)%,实验组高于阴性对照组和空白对照组,实验组细胞活力明显下降,差异均有显著性(p<0.05)。阴性对照组细胞抑制率较空白对照组高,差异有显著性p<0.05),可能是由于转染带来的细胞毒性所致。6. pLVX-c-myc-3对细胞周期的影响PI单染流式细胞术检测细胞周期,实验组G0/G1期的细胞为(72.4±4.6)%,阴性对照组和空白对照组G0/G1期的细胞比例分别为(81.5±4.7)%和(79.3±2.8)%,实验组G1/G1期细胞比例较阴性对照组和空白对照组下降,差异有显著性(p<0.05)。实验组G2/M期的细胞为(19.8±4.4)%,阴性对照组和空白对照组G2/M期的细胞比例分别为(11.6±4.2)%和(12.2±1.8)%,实验组G2/M期细胞比例较阴性对照组和空白对照组升高,差异有显著性(p<0.05)。实验组、阴性对照组S期细胞比例和对照组相比没有明显变化(p>0.05)。7. pLVX-c-myc-3对细胞凋亡的影响转染pLVX-c-myc 72h后,利用Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡。实验组早期凋亡细胞比例(25.6±4.2)%,阴性对照组早期凋亡细胞(15.1±4.2)%,空白对照组早期凋亡细胞为(12.7±1.8)%,实验组早期凋亡细胞比例明显升高,差异有显著性(p<0.05)。实验组晚期凋亡细胞比例(11.5±4.7)%,阴性对照组晚期凋亡细胞(9.3±4.7)%,空白对照组晚期凋亡细胞为(8.4±2.8)%,实验组晚期凋亡细胞比例明显升高,差异有显著性(p<0.05)。结果显示,与空白对照组相比,阴性对照组早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞比例均有所增加,但差异无显著性(p>0.05)。提示沉默c-myc基因可诱导Jiyoye细胞凋亡结论1.采用第四代慢病毒载体,其优点在于：区别于其它病毒性载体,慢病毒载体免疫原性低,为非致癌性病毒,国外对于慢病毒载体在基因治疗方面已经进行了一系列的从基础到临床的系统研究工作；在其生物安全性方面,基于慢病毒载体HIV-1的体内体外实验中,迄今尚未发现可诱发宿主产生免疫反应,证明其安全性有保证。2.设计合成了三对c-myc特异性的siRNA和一对阴性对照siRNA;分别用real-time PCR和Western-blot检测Jiyoye细胞转染后c-myc mRNA和蛋白表达。三对特异性的siRNA可下调Jiyoye细胞c-myc基因表达。筛选出了沉默效率最高的干扰序列pLVX-c-myc-3,为进一步探讨沉默c-myc基因在白血病和淋巴瘤靶向治疗中的作用提供了实验依据。3.沉默c-myc基因能抑制Jiyoye细胞增殖,诱导细胞凋亡。4.沉默c-myc基因能改变Jiyoye细胞周期,细胞被阻滞在G2/M期。本研究推测沉默c-myc基因抑制Jiyoye细胞的增殖效应机制可能与肿瘤细胞被阻滞在G2/M期,同时诱导肿瘤细胞发生凋亡有关。