背景:随着核能、放射治疗、放射性同位素技术以及航天飞行等的广泛应用,人类受到放射损伤的几率不断增加。放射对组织和器官造成不可逆的损害,除可破坏造血系统外,对骨组织也会造成一定的损伤:抑制骨形成,促进骨吸收,进而引起骨质的快速丢失。骨质疏松通常是放射治疗的长期并发症之一,其主要特征是骨形成减少而骨吸收增强,骨的微结构被破坏以致患者易发生骨折。放射治疗虽然在一定程度上提高了肿瘤患者的生存率,但是放疗后患者易发生骨折,导致其生活质量受到影响。目前骨质疏松药物的治疗效果较好,但是由于通常需要较长的用药周期,大部分药物对患者都存在副作用。因此,进一步探明放射致骨质疏松的病理机制,有利于临床在骨质疏松症预防和治疗过程中寻找疗效强安全性高的药物。成骨细胞以及破骨细胞在骨的内稳态调控过程中扮演不同角色。核因子κB受体激活蛋白配体（Receptor activator of nuclear factorκB ligand,RANKL）可启动破骨细胞分化程序。骨髓中多种细胞可分泌RANKL。放射损伤、炎症刺激、细胞因子、激素等都可促进RANKL的表达。骨保护素（Osteoprotegerin,OPG）是破骨形成的抑制因子,可阻止RANKL介导的下游信号通路的启动。骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem/stromal cells,BM-MSCs）不仅可支持造血,还有成骨、成脂分化能力。BM-MSCs的成骨、成脂定向分化平衡对于维持其造血支持作用和骨内稳态具有关键作用,然而放射损伤打破了这种平衡。放射损伤后BM-MSCs的成骨定向分化减少,骨形成受抑制;BM-MSCs的成脂定向分化增强,即脂肪细胞数量显著增多。但是在放射诱导的骨缺失过程中决定BM-MSCs细胞命运的分子机制不完全清楚。放射导致的骨质疏松,一方面是由于放射抑制了骨形成,而另一方面则是由于放射促进了骨吸收,进而扰乱了骨的内稳态。放射不仅会造成DNA的损伤,还会导致过多活性氧（Reactive oxygen species,ROS）。ROS参与了骨的内稳态调控,如可通过NF-κB通路启动破骨细胞分化程序。Crif1（CR6-interacting factor 1/growth arrest and DNA-damage-inducible,gamma interacting protein 1,Crif1）不仅参与了线粒体核糖体大亚基的构成,还可诱导细胞周期阻滞、调控细胞氧化应激及细胞放射抗性以及转录因子的转录活性,参与调控细胞的多种生理功能。我们的前期研究表明Crif1可通过cAMP/PKA信号通路促进放射后BM-MSCs的成脂分化。近期的研究表明,Crif1在肝癌细胞中存在异常高表达,并且可通过ROS/NF-κB通路促进肝癌细胞的生长及转移。本研究中,应用放射致小鼠骨质疏松模型及Crif1骨髓特异性条件敲除小鼠Lyz2Cre;Crif1fl/fl证实Crif1参与调控骨质疏松形成的作用,在体外实验中探讨了相关的分子机制,并以Crif1的His120为靶点进行了Life Chemicals化合物库的生物信息学筛选,筛选出五种可显著抑制RNAKL分泌及成脂分化的小分子化合物。材料和方法:1.建立放射致小鼠骨质疏松模型并检测放射损伤后Crif1在骨髓细胞中的表达情况。1)5Gy的Co-60γ全身照射小鼠,建立放射致小鼠骨质疏松模型;Micro-CT、H&E染色等技术检测放射后小鼠骨损伤情况;2)检测放射损伤后骨髓细胞中Crif1及破骨细胞分化相关因子RANKL、OPG的表达情况。2.构建Crif1骨髓特异性条件敲除小鼠Lyz2Cre;Crif1fl/fl,证实Crif1参与放射后骨质疏松的形成。1)构建Crif1骨髓特异性条件敲除小鼠Lyz2Cre;Crif1fl/fl;2)5 Gy的Co-60全身照射Lyz2Cre;Crif1fl/fl小鼠及相应对照组小鼠;Micro-CT、H&E染色等技术检测放射后小鼠骨损伤情况;3)检测放射损伤后骨髓细胞中破骨细胞分化相关因子RANKL、OPG的表达情况。3.在破骨前体细胞中,探讨Crif1通过NF-κB通路促进破骨细胞分化的分子机制。1)检测放射后RAW264.7细胞内ROS水平、细胞增殖、细胞凋亡及向破骨细胞分化的变化情况;检测放射后NF-κB和MAPKs蛋白家族中蛋白磷酸化水平;2)敲除RAW264.7细胞中的Crif1,探讨缺失Crif1后对RAW264.7细胞内ROS水平、细胞增殖、细胞凋亡及向破骨细胞分化的影响;3)敲除RAW264.7细胞中的Crif1,检测放射后NF-κB和MAPKs蛋白家族中蛋白磷酸化水平变化;探明放射前后Crif1与NF-κB p65在细胞内的定位情况及NF-κB p65在细胞核内分布情况。4.在骨髓间充质干细胞中,进一步探讨Crif1通过cAMP/PKA通路参与破骨细胞分化调控的可能机制。1)在BM-MSCs中过表达Crif1,探讨其对RANKL、OPG的表达及破骨细胞分化的影响;2)敲除BM-MSCs中的Crif1,探讨其对RANKL、OPG的表达、破骨细胞分化及成脂分化的影响;3)分别添加PKA的激动剂及抑制剂,证实Crif1通过cAMP/PKA信号通路促进RANKL的表达,进而促进破骨细胞的分化。5.以Crif1的His120为靶点通过生物信息学筛选Crif1的小分子化合物抑制剂。1)以Crif1的His120为靶点的Life Chemicals化合物库的生物信息学筛选;2)小分子化合物对几种细胞系的细胞毒性检测;3)小分子化合物的有效性检测:小分子化合物添加到BM-MSC中后,检测RANKL、OPG的分泌情况及RANKL/OPG比值变化情况;检测CREB磷酸化水平变化情况;检测BM-MSCs成脂分化变化情况。结果:1.放射致小鼠骨质疏松并诱导骨髓细胞高表达Crif1。1)小鼠经5 Gy放射处理后7d,取左腿股骨。Micro-CT分析显示放射后小鼠的骨体积分数（BV/TV）、连接密度（Conn.D）、骨小梁数量（Tb.N*）、骨矿物密度（v BMD）等指标显著降低;而骨小梁间隙（Tb.Sp*）、结构模型指数（SMI）则显著升高,骨小梁厚度（Tb.Th*）在未放射组及放射组小鼠中差异不显著;H&E染色显示放射后小鼠的骨小梁数量显著减少,骨髓腔内脂肪细胞显著增多;TRAP染色结果显示,放射后小鼠股骨骨髓腔内破骨细胞数量显著增多。以上结果提示,放射导致脂肪细胞及破骨细胞分化增强;2)RT-q PCR结果显示,放射后小鼠骨髓细胞中RANKL的表达显著升高,对OPG的表达无显著影响,RANKL/OPG比值显著升高。值得注意的是,放射后小鼠骨髓细胞中Crif1的表达水平也显著升高;2.条件敲除Crif1可减轻小鼠放射后的骨质疏松。1)RT-q PCR结果显示放射后Crif1敲除组小鼠中RANKL的表达、RANKL/OPG显著低于Crif1未敲除对照组,OPG无显著差异;2)放射前Crif1敲除组小鼠同未敲除对照组的各项指标均无显著差异。尽管放射后Crif1敲除组小鼠及未敲除组小鼠的BV/TV、Conn.D、Tb.N*均显著低于相应未放射组小鼠,但是放射后Crif1敲除组小鼠的BV/TV、Conn.D、Tb.N*显著高于放射后未敲除组;放射后Crif1敲除组小鼠及未敲除组小鼠的Tb.Sp*均有所升高,但值得注意的是,放射后Crif1敲除组小鼠的Tb.Sp*显著低于放射后未敲除组小鼠;3)小鼠经5 Gy放射后7d,敲除组小鼠股骨骨髓腔内破骨细胞数量显著低于未敲除组。3.Crif1通过NF-κB通路促进破骨细胞的分化。1)放射诱导RAW264.7细胞内ROS水平升高,抑制其细胞增殖并诱导其细胞凋亡;2)放射诱导RAW264.7细胞高表达Crif1并分化为破骨细胞;3)敲除Crif1导致RAW264.7细胞内ROS水平升高,放射后向破骨细胞分化减少;4)敲除Crif1导致放射后NF-κB p65的磷酸化水平减低;5)敲除Crif1导致放射后NF-κB p65入核减少。4.Crif1通过cAMP/PKA通路促进RANKL的表达。1)过表达Crif1促进RANKL的分泌及破骨细胞的分化;敲除BM-MSCs中的Crif1可显著降低放射前后RANKL的表达及RANKL/OPG比值;放射及未放射组中,敲除Crif1均可显著减少TRAP阳性细胞;2)敲除BM-MSCs中Crif1可显著降低其向脂肪细胞分化的能力以及成脂分化后RANKL的分泌;3)RANKL的表达、RNAKL/OPG比值在添加25μM forskolin后显著升高,但是敲除BM-MSCs中Crif1可显著减弱forskolin的这种促进作用;在PKA的抑制剂H-89存在的情况下,RANKL的表达、RNAKL/OPG比值在Crif1过表达BM-MSCs及对照组BM-MSCs中均显著降低;4)过表达Crif1及添加PKA的激动剂forskolin均可显著增加TRAP阳性细胞数量,而敲除Crif1及添加PKA的抑制剂H-89则可显著减少TRAP阳性细胞数量;5)CREB的磷酸化在添加25μM forskolin后显著升高,但是敲除BM-MSCs中Crif1可显著减弱forskolin的这种促进作用;在PKA的抑制剂H-89存在的情况下,CREB的磷酸化在Crif1过表达BM-MSCs及对照组BM-MSCs中均显著降低。5.Crif1抑制剂可以有效抑制RANKL的表达及成脂分化。1)通过虚拟筛选选择了结合自由能<-10.0 kcal/mol的前13种化合物;其中5种化合物F0382-0033、F3408-0076、F1430-0134、F3408-0031、F1430-0130在浓度为25μM时显示了较低的细胞毒性;2)5种化合物均可显著抑制RANKL的表达,降低RANKL/OPG的比值;3)5种化合物均可显著抑制H-BM-MSCs的成脂分化;4)5种化合物可显著抑制由forskolin刺激引起的CREB磷酸化。结论:本研究证实Crif1可通过NF-κB及cAMP/PKA通路在不同细胞中参与破骨细胞分化的调控作用。一方面,在破骨前体细胞中,放射后Crif1介导NF-κB p65的磷酸化及核转位促进破骨细胞的分化;另一方面,在BM-MSCs中,放射后高表达的Crif1促进了RANKL的分泌进而促进破骨细胞的分化,同时也增强了BM-MSCs成脂分化能力。条件敲除Crif1可减轻小鼠放射后的骨质疏松。Crif1抑制剂可以有效抑制RANKL的表达及BM-MSCs的成脂分化。我们的研究进一步丰富了放射诱导的骨质疏松形成的病理机制,为放射诱导的骨损伤提供了新的治疗靶点以及潜在的治疗策略。