背景与目的脑出血（Intracerebral hemorrhage,ICH）是指脑实质内血管破裂引起的颅内出血,包括创伤性脑出血和自发性脑出血。其中,自发性脑出血是第二大常见的脑卒中类型,具有发病率高、死亡率高、致残率高的特点。研究发现,衰老是自发性脑出血发生发展的重要促进因素,然而其在脑出血所致的脑损伤中的作用及机制仍不清楚。衰老具有多种特征性改变,其中表观遗传学异常可在不改变基因序列下调控基因的转录,在衰老研究中备受关注。组蛋白甲基化、乙酰化等修饰改变是其主要的调控机制之一,研究表明H3K27me3（抑制性）、H3K4me3（激活性）和H3K9ac（激活性）修饰不仅是大脑衰老的重要标志,并与神经退行性疾病的进展密切相关,提示上述三种组蛋白修饰可能在衰老导致的脑出血脑损伤加重中具有重要作用。新近的研究发现,取自健康青年人群中的血浆——“年轻血浆”是衰老及衰老相关疾病的有效的治疗方式。年轻血浆中富含各种分泌蛋白、激素、代谢产物或脂质等年轻因子,它们以局部和分泌入血的远距离作用方式影响多种组织器官的衰老进程。研究发现,年轻血浆及其年轻因子可延缓衰老、AD和老年缺血性脑卒中导致的脑损伤,提示年轻血浆极可能同样减轻衰老导致的脑出血脑损伤加重。但至今年轻血浆在衰老导致脑出血脑损伤加重中的作用及机制尚不十分清楚。综上,本研究围绕衰老在脑出血脑损伤中的作用及机制,采用不同年龄阶段的脑出血模型,通过Ch IP-seq、RNA-seq测序和LC-MS/MS等技术,检测H3K27me3、H3K4me3和H3K9ac三种组蛋白修饰在衰老脑出血脑组织中的变化及作用机制,并明确年轻血浆在衰老导致脑出血脑损伤加重中的治疗作用、与组蛋白修饰的关系及可能的关键因子。本研究有望揭示衰老加重脑出血脑损伤的内在分子机制,为老年脑出血患者的治疗奠定扎实的理论及实验基础。材料与方法1、脑出血模型的构建:构建13月龄（中年期）和22月龄（老年期）大鼠脑出血模型,记录脑出血后7天两组的死亡情况,并收集脑出血后第3天的血肿周围脑组织。所有标本收集完毕后立即冻存于-80℃或液氮中。2、脑出血后三种组蛋白修饰分布检测:WB和免疫组化检测不同年龄阶段脑出血后第3天中三种组蛋白修饰整体标记水平和细胞定位的变化。Ch IP-seq检测三种组蛋白在全基因组中标记基因的变化。3、脑出血后脑组织转录组检测:RNA-seq检测13月龄和22月龄脑出血第3天转录组的变化,并与Ch IP-seq结果作关联分析,并进行q PCR验证。4、年轻血浆干预:构建并联共生小鼠模型:年轻-老年并联、老年-老年并联。并联50天后分离,取老年鼠构建脑出血模型,检测脑损伤和H3K27me3及H3K9ac组蛋白修饰。同时收集年轻和老年大鼠血浆,在老年大鼠脑出血后30min经尾静脉输注,观察脑损伤变化。5、血浆成分检测:收集青年、中年、老年健康人群的血浆,LC-MS/MS筛查血浆中蛋白的变化。从中筛选“年轻因子”,并通过ELISA、q PCR在不同年龄大鼠血浆和脑组织中进行验证。6、脑损伤指标检测:检测脑出血后7天的死亡率并绘制生存曲线、神经功能缺损评分（Modified Neurological Deficient Score,m NDS）,评估出血第3天脑含水量（Brain water content,BWC）变化,利用TUNEL、FJB、Nissl染色检测出血后第3天血肿周围脑组织神经元的损伤情况。7、其它:给予脑出血大鼠干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）抗体或胰岛素样生长因子（Insulin-like growth factors,IGF-1）蛋白,检测年轻血浆治疗在衰老导致脑出血脑损伤加重中的关键效应通路。结果1、衰老导致脑出血脑损伤加重:相较于13月龄（中年期）,22月龄（老年期）大鼠脑出血的7天死亡率和m NDS均更高,且脑出血第3天的BWC及TUNEL、FJB阳性的损伤神经元的数量皆显著升高。2、衰老脑出血鼠H3K27me3及H3K9ac组蛋白修饰在基因组中存在显著重分布:脑出血后H3K4me3、H3K27me3及H3K9ac整体修饰水平皆可呈现不同程度的变化。其中,H3K27me3修饰13月龄和22月龄组中均显著下降;H3K4me3修饰水平在两组中呈下降的趋势但差异无统计学意义;H3K9ac修饰仅在22月龄脑出血中显著升高。Ch IP-seq分析结果提示三种组蛋白修饰皆主要分布在基因组TSSs区域,提示其主要参与基因转录的调控。进一步的GO分析发现三种组蛋白修饰在不同年龄阶段参与调控的分子通路截然不同。3、H3K27me3及H3K9ac组蛋白修饰重分布导致老年脑出血大鼠炎症和免疫反应相关因子的上调:RNA-seq结果提示不同年龄阶段脑出血后均可显著上调IFN-γ、氧化脂质相关代谢酶等多种炎症和免疫反应相关分子,然而上述分子在13月龄和22月龄两组中的表达水平存在一定的差异,这种差异可能因大脑的衰老所致。进一步与Ch IP-seq关联分析发现在22月龄脑出血大鼠中,H3K27me3与H3K9ac组蛋白修饰相应的差异表达基因与RNA-seq中上调的差异表达基因大量重合;13月龄脑出血大鼠则以H3K4me3与H3K9ac相应基因为主。GO分析表明这些重合的基因主要参与脑出血后炎症和免疫反应。4、年轻血浆应用可减轻衰老导致的脑出血脑损伤加重,IGF-1可能在其中发挥重要作用:利用年轻鼠与老年鼠的并联模型发现,年轻鼠的并联可显著降低老年鼠脑出血的死亡率、m NDS及BWC,同时TUNEL、FJB和Nissl染色均提示年轻鼠并联组中,脑血肿周围损伤或凋亡的神经元数量显著减少;通过尾静脉年轻血浆的输注模型发现,年轻血浆应用同样可以减少老年脑出血大鼠的死亡率、m NDS、BWC及神经元损伤。由此可见,年轻血浆的应用可减轻衰老导致的脑出血脑损伤加重。LC-MS/MS分析不同年龄阶段人类血浆内蛋白成分及含量变化,发现血浆中IGF-1随年龄的增大显著下降。通过ELISA在脑出血大鼠中进行验证,发现IGF-1随大鼠月龄增大而减少,衰老可抑制脑出血后IGF-1的表达;年轻血浆的输注可提高衰老脑出血脑组织中IGF-1的含量,进一步研究发现这些增多的IGF-1并非来源于脑组织自身的表达,而是可能来源于血浆中富含的IGF-1。进一步将IGF-1重组蛋白输注于老年的脑出血大鼠中发现,IGF-1可明显减轻衰老导致的脑出血脑损伤加重。5、H3K27me3与H3K9ac组蛋白修饰参与年轻血浆对老年脑出血中炎症及免疫反应的调控:WB及组化结果提示,年轻血浆的治疗可一定程度上逆转H3K27me3与H3K9ac组蛋白修饰在老年脑出血中的分布水平。Ch IP-seq结果发现H3K27me3或H3K9ac组蛋白修饰的IFN-γ、Lrg1等多种炎症和免疫分子可被年轻血浆所改变,从而并抑制其转录表达。进一步的我们应用IFN-γ抗体后,老年脑出血大鼠的死亡率、m NDS、BWC及神经元损伤均显著下降,提示对IFN-γ的抑制作用可能是年轻血浆发挥抗衰老脑出血脑损伤的重要途经。结论衰老作为脑出血的重要危险因素,可显著加重脑出血导致的脑损伤。H3K27me3、H3K4me3和H3K9ac三种组蛋白修饰的重分布在衰老加重脑出血损伤中伴有重要作用。其中,衰老主要介导H3K27me3修饰的减少和H3K9ac修饰的增多,且H3K27me3及H3K9ac修饰的重分布可促进衰老脑出血后炎症和免疫反应相关因子表达的上调。年轻血浆可一定程度逆转H3K27me3与H3K9ac组蛋白修饰在老年脑出血鼠中的重分布、抑制IFN-γ等促炎性因子的表达,从而减轻衰老导致的脑出血脑损伤加重。