论文部分内容阅读
背景与目的肠缺血再灌注（I/R）通常发生于多种病理过程中,例如创伤、失血性休克、肠梗阻、严重烧伤、小肠移植和其他一些大的手术。急性小肠I/R往往会引起严重的肠上皮损伤,导致肠上皮屏障功能丧失,引起细菌易位,进而引发全身性炎症反应最终可能造成多器官功能衰竭。当肠I/R损伤发展为休克,多器官功能衰竭和败血症时,死亡率特别高。肠I/R损伤的潜在机制非常复杂,越来越多的研究表明,肠屏障功能障碍在肠I/R损伤的发生发展中起到关键作用。肠上皮屏障（IEB）是肠腔和肠粘膜之间重要的防御屏障,肠上皮屏障包括完整的肠上皮细胞（IEC）和IEC之间的紧密连接（TJs）。紧密连接是由一群跨膜蛋白包括claudins、occludin、Zonula Occludens（ZO）等组成的蛋白复合体,位于上皮细胞膜的顶端,可以调控肠道水、离子和营养物的吸收转运。有证据表明,紧密连接蛋白表达或分布的破坏是导致肠I/R中肠通透性增加和肠上皮屏障功能障碍的重要原因。白介素28A（IL-28A或干扰素λ2）是三型干扰素家族的一员,研究表明IL-28A参与了肠粘膜稳态的维持,但是具体机制尚不明确。最近的一项研究表明,IL-28A可促进结肠炎小鼠中肠上皮细胞的增殖并加速肠粘膜损伤的愈合。另外的一项研究发现,外源性IL-28可通过调控血管内皮细胞紧密连接加强血脑屏障。但是,关于IL-28A在肠I/R和肠上皮屏障功能中的作用和机制的研究尚未有报道。本课题构建小鼠小肠I/R模型和Caco-2细胞缺氧模型,通过免疫组化,蛋白印迹,跨上皮电阻测量,免疫荧光等技术,研究IL-28A在小鼠小肠组织的表达以及对小鼠小肠I/R损伤和肠上皮屏障功能的作用,初步探索了可能涉及的分子机制。研究方法1.将成年C57BL/6小鼠随机分成三组:Sham,I/R和I/R+IL-28A。I/R+IL-28A组的小鼠在手术前12小时腹腔注射重组小鼠源IL-28A。构建小鼠小肠急性I/R模型,用血管夹夹闭肠系膜动脉根部,30分钟后恢复血供,6小时后处死所有小鼠。通过蛋白印迹法和免疫荧光染色评估Sham和I/R组中IL-28A的表达。通过渗透性示踪剂FITC标记的葡萄聚糖4000评估小肠的渗透性。收集小肠标本并照相。通过苏木素-伊红（H&E）染色和Chiu’s评分进行组织学分析。2.通过蛋白印迹法和免疫组化染色检测TJ蛋白（ZO-1、occludin和claudin-1）的表达和分布。通过蛋白印迹和免疫荧光染色评估信号转导和转录激活因子1（STAT1）和p STAT1的表达。3.在体外建立人肠上皮Caco-2细胞缺氧模型,并给予重组人源IL-28A刺激12小时,通过测量跨上皮电阻（TER）评估上皮通透性。通过蛋白印迹法评估紧密连接蛋白和STAT1/p STAT1的表达。通过免疫荧光染色检测claudin-1的表达和分布。4.在体外用小分子抑制剂氟达拉滨抑制STAT1的活化,设置浓度梯度寻找抑制效果最好的浓度。用抑制效果最佳浓度的氟达拉滨与IL-28A共同作用Caco-2细胞,通过蛋白免疫印迹实验检测紧密连接蛋白和STAT1/p STAT1的表达,通过免疫荧光染色检测claudin-1的表达和分布。研究结果1.免疫荧光结果显示,表达IL-28A的细胞主要在小肠的固有层中,并且I/R组IL-28A阳性细胞的相对数量比假手术组明显降低。蛋白质印迹结果显示,与假手术组相比,I/R组IL-28A蛋白的表达量明显降低。2.IL-28A处理明显减轻了I/R导致的的小肠组织水肿和充血。组织学检查显示,I/R引起小肠绒毛缩短,上皮表面脱落,大量隐窝丢失和免疫细胞浸润,而外源性IL-28A处理缓解了上述粘膜损伤。3.与假手术组相比,I/R导致小鼠血清中FITC标记的葡萄聚糖水平升高,而IL-28A处理则部分缓解了FITC标记的葡萄聚糖的升高。免疫组化结果显示,IL-28A处理可显著减轻小肠I/R引发的紧密连接蛋白的破坏,其中包括ZO-1、occludin和claudin-1。免疫印迹表明,在I/R条件下,IL-28A可以促进claudin-1蛋白水平的表达,但对ZO-1和occludin的表达量没有明显影响。4.在体外实验中,无论常氧或低氧环境,IL-28A均可以上调Caco-2单细胞层的跨膜电阻。蛋白质印迹实验表明,低氧明显降低了Caco-2细胞紧密连接蛋白ZO-1,occludin和claudin-1的表达。外源性IL-28A对Caco-2细胞ZO-1和occludin的表达没有影响,但无论在常氧或低氧条件下均上调了claudin-1的表达。5.IL-28A在体内和体外均促进下游信号分子STAT1的活化。在体外Caco-2细胞中,氟达拉滨可抑制STAT1磷酸化,且抑制效果与作用浓度成正相关。氟达拉滨在抑制STAT1磷酸化的同时降低claudin-1的表达,并逆转了IL-28A介导的claudin-1的表达上调,但氟达拉滨对ZO-1和occludin的表达没有影响。结论1.IL-28A主要在肠道固有层中表达,I/R导致小鼠小肠中IL-28A的下调。IL-28A维持肠屏障功能并减轻了小肠急性I/R损伤。2.在小鼠小肠I/R模型和体外Caco-2细胞缺氧模型中,IL-28A均维持了肠上皮紧密连接的分布,并上调了claudin-1的表达。3.抑制STAT1的磷酸化可以逆转IL-28A对Caco-2细胞中claudin-1表达和分布的影响。IL-28A在肠屏障上的保护作用可能是通过JAK-STAT1通路实现的。