目的:在哺乳动物中,端粒由TTAGGG的重复DNA序列及端粒结合蛋白Shelterin共同组成,端粒在维持染色体完整性、防止染色体融合、保持基因组稳定性等方面发挥着重要作用。但是与大多数基因组DNA不同,端粒DNA的重复序列容易形成高级结构,比如T-loop以及G-quadruplex（G4）等,特别是由于G4结构的存在,DNA双链不能作为DNA复制模板。为了使端粒正常复制,需要打开G4结构。我们前期发现端粒结合复合体CST也具备结合G4的功能,其缺失促成体内G4结构的积累,并导致端粒区复制叉移动变缓以致停滞;另外,CST可以与G4结合,定位在受阻复制叉上使其重新启动。但是,CST结合G4重启受阻复制叉的机制还不明确,我们猜想可能有其他蛋白与CST作用进而发挥功能。我们利用质谱分析与CST相互作用的蛋白,其中RECQ4引起我们关注。RECQ4是RECQ解旋酶家族成员,在DNA复制和高级结构的打开中发挥着重要作用。本课题中,我们一方面要探讨并明确RECQ4在基因组和端粒上的生物学功能,阐明其在端粒复制及端粒DNA损伤中的作用,另一方面要探讨并明确RECQ4与CST相互作用重启端粒受阻复制叉的分子基础,为我们更加全面地了解癌细胞中端粒DNA复制的机制奠定基础,给以抑制端粒复制为手段的肿瘤治疗提供新的靶标和方案。方法:（1）通过质谱和免疫共沉淀（CO-IP）验证RECQ4和CST的相互作用;通过共免疫荧光（CO-IF）验证RECQ4和CST在端粒上发挥作用的相互作用基础。（2）RECQ4是细胞内高表达的蛋白,通过sh RNA构建RECQ4稳定敲减的Hela细胞系,通过si RNA做RECQ4瞬时敲减的细胞,以此为细胞工具,研究其功能。通过流式细胞分析和Ed U掺入的方法验证RECQ4对于细胞周期调控和基因组DNA复制的影响;通过免疫荧光（IF）、微核试验和细胞增殖-毒性试验检测RECQ4对于基因型DNA损伤、染色体异常结构微核和细胞增殖的影响,明确其在维持基因组稳定性上的作用。（3）通过荧光原位杂交（FISH）和免疫荧光-荧光原位杂交技术（IF-FISH）检测RECQ4敲减后对于端粒功能的影响和端粒区特异性DNA损伤的影响,明确RECQ4对于端粒的保护作用。（4）通过荧光原位杂交（FISH）和免疫荧光-荧光原位杂交技术（IF-FISH）检测RECQ4和CST相互作用的机制,明确其相互作用在端粒复制上的作用。通过DNA Fiber和Fiber-FISH技术检测RECQ4和CST对于复制叉重启的作用,明确其相互作用对于基因组DNA和端粒受阻复制叉重启的调控机制。结果:（1）利用质谱和免疫共沉淀技术分析验证得到了与CST相互作用的蛋白RECQ4;共免疫荧光的结果显示,RECQ4可以定位在端粒上,并且与端粒的定位依赖于STN1。（2）利用sh RNA或si RNA构建了RECQ4稳定敲减和瞬时敲减的Hela细胞系。RT-PCR和Western Blot方法均验证了其很好的敲减效率。流式细胞分析和Ed U掺入结果显示,RECQ4敲减后,细胞周期改变,基因组DNA复制效率降低;免疫荧光和微核试验结果显示,RECQ4敲减之后,细胞内DNA损伤水平和染色体异常结构微核数量增加;细胞增殖-毒性检测结果显示,RECQ4敲减后,细胞增殖活性降低,对DNA复制损伤药物的敏感性增加。这些结果表明了RECQ4通过维持细胞内基因组稳定性和正常的复制效率来维持细胞的正常生长和增殖。（3）荧光原位杂交结果显示,RECQ4敲减后,端粒丢失（SFE）和多端粒的信号（MTS）明显增加;免疫荧光-荧光原位杂交结果显示,在RECQ4敲减后,端粒区DNA损伤水平也明显增加。这些结果证明了RECQ4对于端粒功能的作用以及端粒DNA损伤的作用。（4）荧光原位杂交的结果显示,RECQ4和STN1单独敲减后,端粒异常的比例增加,包括MTS和SFE,但是同时敲减RECQ4和STN1时,端粒异常的情况没有额外的增加;同样,免疫荧光-荧光原位杂交的结果显示,RECQ4和STN1单独敲减后细胞内G4数量和端粒区G4所占比例明显增加,当RECQ4和STN1同时敲减后,G4数量也没有额外的增加。这些结果表明RECQ4和CST相互作用,定位于端粒上,通过打开G4结构,可能在一条通路上解决端粒复制问题。（5）DNA-Fiber结果显示,当PDS处理细胞造成复制压力时,在RECQ4和STN1单独敲减的细胞中,DNA复制重启的效率降低;同时,在RECQ4和STN1双敲减的细胞中,DNA复制重启的效率也有降低,但是没有额外降低的趋势;另外,我们通过Fiber-FISH检测了端粒区复制叉状态,结果显示,在RECQ4和STN1单独敲减的细胞中,停滞的复制叉和不能完全进行复制的复制叉增多,这表明RECQ4和CST通过相互作用重启基因组和端粒上受阻的复制叉;但是同时敲减RECQ4和STN1时,不正常的复制叉没有额外增加的趋势。这些结果表明,RECQ4和CST通过相互作用可能在同一条信号通路上发挥重启基因组和端粒上受阻的复制叉的作用。结论:我们发现了与CST复合体相互作用的解旋酶蛋白RECQ4,RECQ4可以以CST依赖性的方式定位在端粒上;为了研究RECQ4功能,我们对RECQ4进行功能验证,发现RECQ4敲减后影响细胞周期和基因组DNA复制,引起DNA损伤和染色体异常,细胞对DNA复制抑制性药物的敏感性增加,导致细胞增殖受到抑制;另外,RECQ4对于端粒功能的维持也发挥着重要作用,当RECQ4敲减后,细胞内端粒丢失和多端粒信号明显增加,端粒区特异性DNA损伤水平也增加。我们发现RECQ4和CST相互作用,可能在同一条信号通路上发挥作用,去打开G4结构,维持端粒正常的复制。最后,通过DNA-Fiber和Fiber-FISH分析得到RECQ4通过和CST的相互作用重启受阻的复制叉以维持基因组和端粒DNA的正常复制。