肺癌是发病率和死亡率增长最快,致死率最高的恶性肿瘤之一,严重威胁人们的健康及生命。血清肿瘤标记物可在一定程度上反映肿瘤的发生和病变。目前,肺癌血清肿瘤标记物联合检测技术的临床应用,提高了肺癌诊断的准确性,具有较强的说服性,已成为肺癌早期临床诊断的主要手段之一。SELEX(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment)技术是在九十年代初发展起来的一种新的组合化学技术,是一种筛选能与目标靶分子高特异性高亲和力结合的寡核苷酸的技术。该技术与PCR体外扩增技术相结合,能够在体外人工构建的随机单链文库中筛选出与靶分子特异性结合的ssDNA或RNA分子,操作简单,筛选周期短,筛选得到的寡核苷酸分子被称为靶标分子的适配体(aptamer)。核酸适配体不仅具备抗体分子的识别特性,而且其结合能力可与抗体相当甚至更强。凡是涉及抗体的诊断领域,几乎都可以用核酸适配体来代替。同时,核酸适配体具有制备简单、成本低廉、稳定性好、靶分子范围广、易于修饰、低免疫原性、可重复使用等诸多优点。因此,肺癌血清肿瘤标记物核酸适配体检测技术可以作为肺癌病人早期诊断的重要手段之一。本文利用消减SELEX技术从肺癌病人血清中筛选出了可与肺癌血清特异性结合的核酸适配体,并对其特异性进行了临床验证。具体研究内容及结果如下:1.血清中高丰度蛋白去除:本实验的实验材料主要是肺癌病人血清。从成分复杂的肺癌血清中筛选与肿瘤蛋白标记物特异性结合的核酸适配体,首先要考虑分离去除血清中大量丰度较高但没有特殊生物学信息的蛋白质,尽可能保留可能作为肿瘤标记物的低丰度蛋白,为肺癌病人血清特异性核酸适配体成功筛选奠定基础。实验采用了乙腈沉淀法去除血清高丰度蛋白,并对乙腈处理血清的比例进行了优化。SDS-PAGE电泳检测结果显示,血清:水:乙腈=1:2:0.5时,效果良好,基本达到了高丰度蛋白去除的目的。2.链霉亲和素磁珠制备:利用亲和素与生物素之间结合力强的特点,在磁珠表面层包被链霉亲和素,并在PCR体系中加入引物bio-P11,扩增得到生物素标记的dsDNA。而后,dsDNA再结合链霉亲和素磁珠,分离制备ssDNA次级文库。链霉亲和素浓度不同,与磁珠的结合效率不同。为此,我们对链霉亲和素与0.05ml磁珠结合的最适浓度进行了优化。结果显示,当链霉亲和素浓度为0.01mg/ml时,链霉亲和素与0.05ml磁珠结合接近饱和,偶联率最高。3.核酸适配体筛选:利用消减SELEX技术以肺癌血清为正筛靶(阳性),正常人血清为反筛靶(阴性)筛选核酸适配体。RT-qPCR检测核酸适配体筛选过程中特异性ssDNA的富集。经过九轮筛选,阴、阳性RT-qPCR曲线明显分离,阴、阳性曲线之间的循环数差几乎都达到了4~6个循环,说明与肺癌血清特异性结合的核酸适配体筛选成功。核酸适配体产物送上海生工测序,获得了肺癌血清标记物核酸适配体序列,选取其中丰度较高的两条链适配体1和适配体2,送上海生工合成。4.核酸适配体与肺癌血清结合特异性的临床验证:分别选取50例肺癌临床病人血清设为阳性,正常人血清为阴性。分别检测肺癌病人血清与适配体1及适配体2结合的特异性。结果显示,50例肺癌临床病人血清的RT-qPCR检测曲线与正常人血清的RT-qPCR检测曲线均明显分离,证明筛选得到的适配体1和适配体2可与肺癌病人血清高特异性结合。本文首次以羧基化琼脂磁珠作为筛选的介质,肺癌病人血清作为靶标,采用消减SELEX技术,筛选与肺癌病人血清特异性结合的核酸适配体;并以50例临床肺癌病例血清为样本分别进行临床检测,验证了筛选获得的两条核酸适配体与肺癌血清结合的特异性,为建立基于核酸适配体的肺癌血清早期诊疗新方法提供了科学依据。