论文部分内容阅读
鲍疱疹病毒(Abalone Herpes Virus,AbHV),赤点石斑鱼神经坏死病毒(Redspotted grouper nervous necrosis virus,RGNNV)和牡蛎疱疹病毒(Ostreid herpesvirus 1,OsHV-1)是对水产养殖动物危害较严重的3种病毒,目前没有有效的治疗方法。海水养殖病害防控“以防为主”。国内外在水产疫病诊断技术方面,已经建立了各种常见水产疫病病原的检测方法,如PCR、qPCR、LAMP、抗原抗体检测、核酸杂交检测等。本研究针对上述3种病毒分别设计了合适的引物和探针,用荧光定量重组酶聚合酶扩增(Quantitative Recombinase polymerase amplification,qRPA)的方法进行检测,通过与荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)比较来评估qRPA试验方法的灵敏度和特异性。结果显示:qRPA对AbHV检测的灵敏度为100拷贝,反应时间仅为20±0.50分钟;在对疑似感染AbHV的杂色鲍(Haliotis diversicolor)样品进行检测时,qRPA和qPCR对AbHV的检测率分别为96%和93%。qRPA对RGNNV检测的灵敏度为100拷贝,反应时间为20±0.50分钟;检测疑似感染RGNNV的石斑鱼(Epinephelussp)样品时,qRPA和qPCR对RGNNV的检测率分别为97%和95%。在对OsHV-1进行检测时,以ORF95为模板设计的引物和探针可以检测到5拷贝的DNA,远高于本研究所采用的qPCR检测的灵敏度(100拷贝);qRPA和qPCR检测疑似感染OsHV-1的毛蚶(Scapharca subcrenata)样品时,对OsHV-1的检测率都是22%。另外,利用qPPA和qPCR分别对感染三种病毒的样品进行验证时,检测结果之间均呈现出较好的相关性,R~2均大于0.8。Whatman FTA卡是一种可以在室温下对各种生物样品进行收集、运输、存档和核酸纯化的滤膜设备。本研究使用FTA卡提取感染GNNV的石斑鱼脑组织中的RNA,运用RT-PCR方法成功检测出了RGNNV。这种提取方式大大简化了病毒提取的步骤,节约时间和成本。为了使检测结果可视化,本研究中还尝试了用RPA结合横向流动试纸条(Lateral flow dipstick,LFD)的方法检测AbHV、RGNNV和OsHV-1,并验证该方法的灵敏度。3种病毒阳性质粒的反应时间为5 min时,LFD对它们的检测限分别是10拷贝、10拷贝、100拷贝。本研究还利用qPCR方法检测了15个沿海城市的毛蚶样品中的OsHV-1感染情况,对毛蚶中OsHV-1的地域分布以及感染率的情况有了深入了解。流行病调查结果显示,除了深圳、大连、连云港和南通地区采集的毛蚶检测到OsHV-1外,其他地区均未检测到该病毒。