目前认为，体内Th1/Th2失衡，Th2优势是哮喘重要的免疫学发病机制之一。对过敏原的免疫不耐受性在哮喘发病机制中的作用是近年研究的热点问题。树突状细胞(Dendritic cell, DC)是体内高效抗原提呈细胞(antigenpresentation cell, APC)，具有高效诱导T细胞分化和增殖以及调节免疫耐受等能力。DC摄取抗原并活化后，其表面MHC-II、共刺激分子和各类趋化因子表达水平增高，随后通过其表面的MHC-抗原肽复合物与T细胞表面受体相互结合，与共刺激分子共同作用，在特殊的细胞因子环境下诱导初始T细胞活化并向不同T细胞亚群分化、增殖。随着研究的深入，越来越多的DC亚群被发现。然而，不同的DC亚群对各类T细胞的活化、分化和增殖能力的影响不尽相同。因此调控DC的功能及表型有可能成为治疗哮喘新的生物学靶点。已有部分实验表明通过基因转染、药物干预等方法影响DC的表型和功能可以有效抑制哮喘的病理表现。但这些方法都存在着安全性和体内可操作性等问题。因此，对于如何安全、有效地调节DC的表型和功能，恢复哮喘患者体内各类T细胞亚群的平衡值得我们深入研究。BCG疫苗是结核分枝杆菌减毒疫苗，应用范围广泛，其安全性和免疫稳定性已得到肯定。流行病学证据表明儿童生长早期接种BCG与其成年后发生过敏性疾病几率呈负相关。在哮喘发病过程中，T细胞发挥核心功能，DC则处于始动地位。多项研究证实BCG免疫调节效应的发挥与其调控DC功能及亚型密切相关。小鼠经BCG免疫后，其脾脏DC可有效抑制哮喘小鼠气道炎症。同时，冻干BCG免疫小鼠后可以提高脾脏中类浆细胞样DC数量。由此看来，基于BCG的哮喘防治疫苗的构建和开发是可行的。由于屋尘螨是引发哮喘的重要过敏源，因此我们前期构建了胞壁特异性表达屋尘螨抗原Der p2的重组BCG疫苗(Der p2rBCG)，并证实Der p2rBCG较BCG更有效抑制Der p2过敏性哮喘炎症。根据这些实验结果，我们推测Der p2rBCG较BCG以更为有效的方式调节体内DC的功能和表型，改变Der p2特异性T细胞亚群分化与功能，减弱或抑制哮喘病理改变。Notch信号途径是调控机体发育过程中的重要途径，具有高度保守性。在哺乳动物体内，Notch信号共有四个受体(Notch1，2,3,4)和五个配体(Jagged-1, Jagged-2, Delta-like1,3,4)。当配体与受体结合后， Notch受体胞内段(Notch intracellular domain, NICD)转入核内，与转录因子RBP-J结合，解除RBP-J对基因转录的抑制作用，同时募集MAML1形成转录共激活物复合体，调控下游靶基因的转录表达。Notch通路受体和配体参与了DC与T细胞相互作用过程，不同受体和配体所产生的效应是不同的。研究发现，DC表面Delta-like1,4(Dll1, Dll4)分子可促进初始T细胞向Th1分化；而在促Th2分化的环境中，DC表面Jagged-2表达上调。Notch3诱导Th1分化，而Notch1、2与Th2分化相关。多篇文献已报道分枝杆菌感染可影响Notch配体的表达水平。同时研究人员发现，BCG进入体内后首先通过其表面病原相关分子模式（Pathogen related molecular protein，PRMP）识别和结合DC表面的TLR9，经MyD88依赖途径影响DC胞内Notch配体的表达，从而调控Th细胞分化发育。那么，Der p2rBCG的调节作用是否也通过调控DC胞内的各类Notch受体、配体表达来实现？值得我们关注。Ⅲ型受体酪氨酸激酶c-kit与其配体干细胞因子（SCF）表达于多种细胞表面，具有广泛的生物学功能，对免疫细胞的分化产生重要影响。经外界过敏原刺激后，DC胞内c-kit及其配体SCF表达水平上调进而影响Th细胞分化。有研究表明，c-kit通过上调DC胞内的IL-6以及jagged-2分子表达促进Th2细胞分化。目前，关于BCG与c-kit及SCF相互作用关系的研究报道很少，因此，Der p2rBCG是否通过上述方式影响DC胞内细胞因子水平改变进而调节jagged-2表达，最终影响Th细胞分化值得我们进一步研究。我们前期研究已显示，Der p2rBCG可有效下调哮喘小鼠气道炎症，其作用机制既涉及调节哮喘Th免疫偏倚，又包括诱导体内CD4~+CD25~+Treg的产生，引起免疫耐受。但对于Der p2rBCG如何产生上述免疫调控的机制尚待研究。鉴于DC在免疫应答反应中的特殊地位，我们以此为着眼点探索Der p2rBCG对DC表型和功能影响及可能的机制，并观察其对各类Th细胞亚群分化的调控及对哮喘病理和病理生理的影响，为临床哮喘疫苗的开发提供实验依据。本课题主要研究结果1. Der p2rBCG对小鼠不同来源DC表型及功能有部分调控作用首先，原代培养小鼠骨髓、脾脏和肺脏来源DC，并经Der p2rBCG刺激72h。FACS分析结果显示：Der p2rBCG体外刺激可有效提高各组DC表面MHC-II、共刺激因子CD80和CD86表达，有效活化DC，其活化能力与BCG无统计学差异。收集各组DC细胞培养液上清，ELISA检测其中细胞因子水平改变，结果显示：Der p2rBCG和BCG均可提高IL-12水平，但前者较BCG更明显提高不同来源DC分泌TGF-β和IL-10水平。此外，BCG上调IL-6水平，而Der p2rBCG促进三种DC分泌IL-6能力较BCG弱；随后利用Der p2rBCG免疫小鼠42天后，分离骨髓、脾脏、肺脏淋巴结DC，FACS检测各组DC表面分子（CD80/CD86/MHCII）改变。结果显示：Der p2rBCG可有效活化脾脏DC和肺脏DC，其活化能力与BCG一致，但对骨髓源性DC影响不明显。将分离的脾脏，肺脏淋巴结DC培养6d后，ELISA检测细胞上清中各类细胞因子含量：IL-12，TGF-β，IL-10趋势与体外结果相似；BCG免疫组脾脏DC培养上清中IL-6含量较高（p＜0.05），但肺引流淋巴结DC上清中IL-6含量则无明显变化（p＞0.05）；Der p2rBCG免疫组的脾脏DC和肺脏淋巴结DC上清中IL-6含量与对照组比较无显著差异。另外，我们发现Der p2rBCG体内免疫后可明显提高小鼠腹腔引流淋巴结pDC的细胞比例及绝对数，而BCG则无此作用。2. Der p2rBCG调节DC诱导Th0细胞向不同Th亚群分化。我们首先利用CD4~+CD62L~+免疫磁珠试剂盒从正常小鼠脾脏分离CD4~+CD62LhiT (Th0)细胞，分选效率达85%以上，将Th0细胞与经PS/BCG/Der p2rBCG刺激的DC，按5：1比例共培养，经Der p2抗原刺激72h，随后收集T细胞，经FACS检测Th0细胞向各个亚群分化比率。结果显示：与PS比较，Der p2rBCG和BCG具有更强诱导Th1亚群分化和抑制Th2亚群分化的功能。同时，我们发现BCG可诱导体外Th17细胞分化，但Der p2rBCG则无此作用。值得注意的是，Der p2rBCG比BCG组具有更强的诱导CD4~+CD25~+Foxp3~+T细胞产生的能力。体内试验中，我们将PS/BCG/Der p2rBCG免疫小鼠42天后制备哮喘模型，分离肺脏引流淋巴结，用尼龙膜过滤制成单细胞悬液，FACS分析结果显示：Der p2rBCG和BCG均可抑制哮喘小鼠Th2细胞过度分化，上调Th1细胞；前者明显减少Th17比例，而后者则促进Th17的产生；前者显著提高CD4~+CD25~+Foxp3~+T细胞比率，而后者的影响并不明显。3. Der p2rBCG调节DC功能的分子机制以上2部分实验初步证实了Der p2rBCG具有通过调控DC功能及表型从而影响Th0细胞向各个不同Th细胞亚群分化的能力。随后，我们初步研究了参与这种调控的分子信号通路。我们利用Real-time PCR和Western blot方法检测到Der p2rBCG与BCG均能显著上调DC内Dll-4的表达水平，但对Dll-1、3表达均无明显影响。Der p2rBCG可下调DC内Jagged-2表达，其作用能力较BCG更强。OxPAPC可阻断Der p2rBCG的上述作用。Der p2rBCG刺激DC内c-kit表达的能力较BCG低。4. Der p2rBCG-DC在哮喘小鼠模型中发挥免疫调节作用为进一步证实经Der p2rBCG调控的DC在体内具有免疫调节能力，我们进行了体内DC移植实验。首先分离出经PS/BCG/Der p2rBCG免疫后的小鼠腹腔淋巴结DC，将其移植入Der p2抗原致敏的小鼠体内，再经抗原激发构建哮喘小鼠模型。实验动物分6组：正常小鼠组、哮喘模型组、Derp2rBCG-DC移植组、BCG-DC移植组、PS-DC移植组和Der p2rBCG-DC移植+PC61组。经HE，AB-PAS染色法观察小鼠肺组织病理学改变，结果显示：Der p2rBCG-DC移植组小鼠肺组织炎症较哮喘模型组明显减轻，气道粘液分泌减少；Der p2rBCG-DC可降低哮喘小鼠气道高反应性；ELISA结果提示：Der p2rBCG-DC移植组小鼠肺泡灌洗液中Th1细胞因子上调，Th2细胞因子下调，调节性细胞因子TGF-β, IL-10水平增高；FACS结果显示Der p2rBCG-DC移植组小鼠肺脏引流淋巴结中Th1，CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg细胞比例及绝对数上升，而Th2细胞亚群比例及绝对数下降；值得注意的是，使用Treg清除剂PC61可有效逆转该现象。结论1） Der p2rBCG与BCG一样可上调DC表面MHC-II、共刺激因子CD80和CD86表达水平，有效活化DC。此外，Der p2rBCG体内免疫还可以提高小鼠腹腔引流淋巴结中pDC的比例与细胞绝对数；2）Der p2rBCG对DC诱导Th0向各个Th细胞亚群分化产生重要影响。Der p2rBCG与BCG相似，均能刺激不同来源DC释放Th1细胞因子，但前者能更有效地刺激DC分泌调节性细胞因子TGF-β，IL-10，从而具有更强的诱导CD4~+CD25~+Foxp3~+T细胞分化的能力。Der p2rBCG促DC分泌IL-6能力较BCG弱；3）Der p2rBCG通过TLR途径调控DC内Notch配体表达，进而影响Th1/Th2细胞亚群比例；4）Der p2rBCG促进DC内c-kit表达能力较BCG低，因此产生较少的IL-6，从而诱导Th17细胞分化功能也较低。