研究背景与目的结直肠癌(colorectal cancer, CRC)恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率分别位居所有癌症第三位和第四位,全球每年新发病人数超过100万,死亡人数达55万,并且呈上升态势。在治疗上,目前以手术为主,但结直肠癌早期多无明显症状,很多患者确诊时已属中晚期,有远处病灶转移,常失去外科手术和放疗机会；因此,在结直肠的治疗方面,药物的作用就尤为重要。遗憾的是,目前对于结直肠癌的药物治疗,还缺乏持久有效的治疗药物,因为这些常用药,尽管有不同的靶位和机理,但均引起肿瘤细胞的凋亡,肿瘤细胞通常开始对凋亡诱导较敏感,但最终产生凋亡耐受。因此,为了提高结直肠癌患者的总的生存率,寻找一种能够避开凋亡抵抗、诱导CRC细胞死亡的药物并阐明其调控机制其具有重要的科学意义和临床价值。小白菊内酯(Parthenolide, PTN)是从菊科植物中提取的一种倍半萜内酯化合物,小白菊内酯过去主要用于治疗偏头痛,风湿病及炎症。近年来研究发现,小白菊内酯具有较强的抗肿瘤活性,还可以增强肿瘤细胞对其他多种抗肿瘤药物的敏感性。比如：肝癌,胆管癌,急性、慢性白血病和多发性骨髓瘤。既往研究表明,小白菊内酯既具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的作用,也具有引起细胞坏死的效果,小白菊内酯对结直肠癌的作用及其诱导CRC死亡的方式及其机制研究尚不清楚。鉴于此,本课题拟进行小白菊内酯对结直肠癌的作用、死亡方式及其调控机制的研究。细胞死亡根据形态学上的不同可分为细胞凋亡和细胞坏死。细胞凋亡是细胞程序化的主动消亡过程,而细胞坏死则是发生于各种不同生理或病理状况的被动性死亡。最近的研究发现,有部分坏死可能像凋亡那样,由特定因子启动,按照一定通路和程序发生,这种可调控性坏死被命名为Necroptosis。Necroptosis的发现,使得对坏死的调控成为可能,对生命科学研究和疾病的临床治疗产生革命性影响,ecroptosis能够克服临床上抗肿瘤药的多药耐药性,提高临床疗效。受体相互作用蛋白家族(Receptor-interacting protein 3, RIP3)是介导Necroptosis的经典通路之一,在(tumor necrosis factor α, TNF-α)诱导的Necroptosis中起关键调控作用。RIP3是TNF-α诱导的细胞凋亡与细胞坏死相互转换的分子开关。RIP3不会影响RIP1介导的细胞凋亡,但却是RIP1介导的细胞坏死所必需的,RIP3能使坏死特异性激酶RIP1磷酸化,RIP1和RIP3形成稳定的坏死复合物II,激活下游促坏死激酶活性,导致细胞发生necroptosis。同时Caspase的广谱性抑制剂z-VAD-FMK所导致的细胞坏死也需要RIP3的参与,RIP3是多种细胞发生necroptosis所必需。近来,韩家淮课题组认为,ecroptosis可以分为RIP3依赖的和非RIP3依赖两种类型。我们拟应用不同的等基因细胞系,RIP3+/+和RIP3-/-的小鼠胚胎成纤维细胞系(mouse embryonic fibroblast, MEF)和成纤维细胞NIH-3T3,探讨小白菊内酯诱导结直肠细胞死亡的机制。研究内容与方法本研究主要分五部分内容开展：1在体分析小白菊内酯对结直肠癌生长的作用根据文献方法建立可视化裸鼠原位结直肠癌动物模型,在活体成像系统下观察,12天后,原位实体瘤形成,将12只荷瘤鼠随机分为两组,每组6只,一组小白菊内酯干预组,皮下注射10 mg/kg/day小白菊内酯,给药2周,另一组溶剂对照组。实验前后记录裸鼠体重及应用活体成像系统检测瘤体荧光强度。2细胞水平验证小白菊内酯对SW480细胞的影响实验采用MTT法检测小白菊内酯对SW480细胞活力的影响,将细胞分为5大组：即5,10,20,40μM小白菊内酯组及溶剂对照组,加药后分别培养12h和24 h。3小白菊内酯诱导SW480细胞的死亡方式的鉴定将细胞分为2组：对照组,小白菊内酯20 μM组,分别培养相应的时间。小白菊内酯干预后,采用ELISA法和Western Blot法分析小白菊内酯对Caspase-3的影响,MTT法检测z-VAD-FMK对小白菊内酯干预的SW480细胞存活率的影响,流式细胞仪检测细胞凋亡亚二倍体峰,Hoechst33342/PI染色法观察细胞形态并计算坏死的比例,荧光染料Annexin V-FICT/PI染色,流式细胞仪分析对凋亡和坏死的影响,流式细胞仪检测细胞内活性氧含量及线粒体膜电位的变化。4探讨小白菊内酯诱导SW480死亡的调控机制将细胞分为2组：对照组,小白菊内酯组,加药后培养相应时间后,采用MTT法检测不同浓度小白菊内酯不同浓度和时间对NIH-3T3细胞(A与N)及MEF (RIP3-/-与RIP3+/+活力的影响,探讨小白菊内酯诱导SW480细胞死亡是否通过RIP3这条通路,进一步用Western Blot法分析其调控机制。5鉴定小白菊内酯诱导A细胞(RIP3-/-)的死亡方式将细胞分为2小组：对照组,小白菊内酯组,加药后培养12 h。Hoechst33342/PI染色法观察细胞形态,荧光染料Annexin V-FICT/PI分析对凋亡和坏死的影响,透射电镜观察超微结构。统计方法采用SPSS 13.0统计软件进行分析,结果表示为：均数±标准差(x±Sd)。组间比较单因素分析采用One Way-ANOVA,方差齐采用LSD法,方差不齐的采用Dunnett T3法；各组间比较采用重复测量方差分析；两组比较采用两独立样本t检验；组间比较单因素分析采用独立样本t检验,多因素采用两个重复测量因素的方差分析。P<0.05表示有统计学意义。结果1小白菊内酯抑制可视化裸鼠原位结直肠癌生长动物实验发现,与对照组相比,小白菊内酯处理后裸鼠瘤体相对荧光强度明显减弱,有显著的统计学差异,小白菊内酯抑制可视化裸鼠原位结直肠癌生长。2小白菊内酯降低SW480细胞的活力MTT法显示,小白菊内酯显著降低SW480细胞的活力,并呈时间和剂量依赖性。在20 μM时,细胞存活率接近50%,故选用20μM进行后续的实验。3小白菊内酯诱导人结直肠癌SW480细胞凋亡性坏死经典的细胞凋亡被定义为Caspase介导的细胞死亡,本实验发现,给予小白菊内酯干预后,Caspase-3的活力没有显著激活,且泛Caspase抑制剂z-VAD-FMK没有显著阻断小白菊内酯诱导的细胞死亡。另外,流式细胞仪未检测到显著的凋亡峰；应用PI和Hoechst33342染色观察,细胞在死亡早期出现细胞膜破损(PI染色阳性),但未有细胞核固缩,断裂凋亡小体等显著的凋亡特征；应用PI和Annexin V-FICT染色,流式细胞术分析,发现小白菊内酯诱导SW480细胞以细胞坏死为主(PI染色阳性),而非凋亡(Annexin V-FICT染色阳性)；综上前人的研究,小白菊内酯主要诱导人结直肠癌SW480细胞凋坏死,既往研究发现凋亡性坏死伴随着活性氧的急剧升高,导致细胞线粒体内膜通透性增大至线粒体膜电位显著下降,故本研究进行了给予小白菊内酯干预后,细胞内活性氧含量和细胞线粒体膜电位的检测。荧光染料DCFDA显示细胞内ROS水平升高,JC-1染色后流式细胞仪统计发现小白菊内酯可以引起线粒体膜电位迅速下降,以上结果表明小白菊内酯诱导细胞凋亡性坏死且这个过程伴随着活性氧的升高和线粒体膜电位下降。4小白菊内酯诱导细胞发生凋亡性坏死依赖于COX-2而不依赖于RIP3通路我们设想小白菊内酯可能通过活化RIP3通路,引起N细胞发生凋亡性坏死。结果与我们的预期相反,小白菊内酯20μM显著增加A细胞(RIP3-/-)死亡而不是N细胞(RIP3+/+)；然而,小白菊内酯对MEF两种细胞(RIP3-/-和RIP3+/+)的死亡并无显著差异；表明小白菊内酯诱导细胞凋亡性坏死是非RIP3依赖的。那么,PTN在两类细胞系的差异是如何引起的呢?小白菊内酯是NF-κB的特异性抑制剂,且NF-κB调控COX-2的表达。另外,80%的结直肠癌中COX-2表达阳性,我们设想小白菊内酯诱导细胞发生凋亡性坏死可能以COX-2有关。进一步研究发现,A细胞COX-2表达阳性,N细胞COX-2表达阴性,而MEF两种细胞(RIP3-/-)和RIP3+/+)COS-2均表达阳性,提示小白菊内酯对两种细胞系的作用不同是由COX-2引起的；进一步研究发现,小白菊内酯降低COX-2表达；以上结果表明小白菊内酯诱导细胞凋亡性坏死是依赖于COX-2。5小白菊内酯诱导A细胞(RIP3-/-)的死亡方式本研究应用PI和Hoechst33342染色,给予小白菊内酯干预后,细胞在死亡早期出现细胞膜破损(PI染色阳性),具有细胞膜完整性缺失等坏死样特征,但未有细胞核固缩,断裂凋亡小体等显著的凋亡特征；应用PI和Annexin V-FICT染色,流式细胞术分析,发现小白菊内酯诱导SW480细胞以细胞坏死为主(PI染色阳性),而非凋亡(Annexin V-FICT染色阳性)；透射电镜观察显示,小白菊内酯组,A细胞线粒体和细胞核肿胀,内质网扩张显著,胞内可见自噬小体,无显著凋亡小体的形成,表明小白菊内酯诱导A细胞(RIP3-/-)凋亡性坏死。结论1小白菊内酯10 mg/kg/d抑制BARB/c裸鼠肿瘤生长。2小白菊内酯20μM能诱导人结直肠癌细胞SW480和来源小鼠胚胎成纤维细胞NIH-3T3的A细胞凋亡性坏死。3这种凋亡性坏死依赖于COX-2而不依赖于RIP3。