甜瓜(Cucumis melo)是热带和温带地区的一种重要葫芦科作物,也是我国的重要经济作物。瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbci chloratic yellows virus,CCYV)主要侵染甜瓜并且严重影响甜瓜的品质。CCYV由两条正单链RNA构成的病毒,分别为RNA1和RNA2,属于长线形病毒科毛型病毒属,P22是RNAl的3’末端编码的一个分子量为22 KDa的病毒蛋白,本实验利用酵母双杂交系统,筛选与P22蛋白互作的寄主因子,从而阐明P22蛋白在病毒侵染过程中的作用机制。主要研究内容和结果如下:克隆了瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)P22蛋白基因,并在大肠杆菌BL21中得到高效表达。以被瓜类褪绿黄化病毒侵染的甜瓜叶片为供试材料,应用RT-PCR方法克隆其P22蛋白基因,并将其连接到原核表达载体pGex-4T-3上,PCR验证及克隆测序确定开放阅读框的正确性。将重组载体pGexp22转化大肠杆菌BL21菌株,诱导表达,SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,P22基因在大肠杆菌BL21中得到高效表达。成功制备了 CCYVP22的特异性抗血清。以表达的蛋白为抗原,免疫家兔,制备了 CCYVP22的特异性抗血清。ACP-ELISA检测结果表明,血清效价高达1.28×105。Western blot检测甜瓜叶片,结果表明抗血清能够特异性地检测CCYV侵染的甜瓜叶片的CCYVP22蛋白。构建了甜瓜cDNA酵母文库,筛选出了 Rpol、M2、M39等3个可与P22互作的蛋白因子,分析测定了 3个蛋白因子与P22互作的功能域。以提取甜瓜叶片总RNA为供试材料,应用SMART技术构建甜瓜cDNA酵母文库,将P22的全长基因构建到诱饵质粒pGBKT7以获得重组克隆pGBKT7p22,对其进行自激活检测表明该蛋白无自激活活性。将诱饵质粒进行文库筛选获得98个克隆,测序比对后选择同源性比较高且阅读框正确的4个基因,并分别扩增其全长阅读框,将其构建到pGADT7载体上,与P22进行酵母共转化验证。结果表明其中有3个蛋白可以与P22互作,它们分别与 Cucumis sativus uncharacterized(ribosomal prtoein,rpol),Cucumis sativus SKP1-like protein 1A-like,Cucumis sativus SKP1-like protein 1B-like的同源性分别为95%,94%和95‰,并分别命名为Rpol、M2、M39。通过蛋白分析软件对P22蛋白进行功能域分析,将其分为3段分别构建到诱饵质粒pGBKT7,获得重组克隆pGBKT7F1,pGBKT7F2,pGBKT7F3,将其分别与pGADT7M2,pGADT7RPol,pGADT7M39进行共转验证,结果表明M2蛋白能与pGBKT7F2互作,Rpol能同时与pGBKT7F1及pGBKT7F2互作,M39与重组克隆均不能互作。