论文部分内容阅读
目的:肾间质性纤维化(Renal Interstitial Fibrosis,RIF)是导致所有慢性肾脏疾病发展至终末期肾病引起肾衰竭的必经病理过程,其实质是细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)在肾间质中病理性积聚,从而引起肾小管及肾小球的结构改变以及功能衰退。在肾间质纤维化过程中由一系列细胞和分子事件共同参与,多条信号通路相互作用,导致肾间质中细胞及胶原成分聚集增多、肾小管萎缩和扩张、肾单位进行性破坏等间或出现。这些细胞因子、趋化因子及炎症细胞的异常共同介导肾固有成纤维细胞(Fibroblasts,FB)、肾小管上皮细胞转分化为肌成纤维细胞(Myofibroblast,MFB),即上皮细胞-间充质细胞转分化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)。MFB表达α-平滑肌肌动蛋白(α-Smooth Muscle Actin,α-SMA),主要分泌Ⅰ型和Ⅲ型胶原,是RIF的主要效应细胞。转化生长因子β(Transforming Growth Factorβ,TGF-β)是诸多研究证实的重要致纤维化因子,其下游因子胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)在诱发上皮细胞-间充质细胞转分化过程中起到关键作用。血必净有效成分有抗炎、抗氧化、清除抑制自由基、抗血小板聚集、保护血管内皮等功效,现代研究已经证实血必净可延缓肺纤维化、肝纤维化,虽然纤维化形成机制相似,但是血必净在肾间质纤维化中的影响和机制尚不清楚。故本实验通过单侧输尿管梗阻(Unilateral Ureteral Obstruction,UUO)的大鼠模型,给予血必净进行干预,观察其对肾组织中相关致纤维化因子表达的影响,以此探讨血必保护肾脏的可能机制,为临床防治肾纤维化提供实验性理论依据。方法:选择54只健康、清洁级雄性大鼠,体重180~220g,进行适应性喂养,1周后将大鼠随机分为三组,1.假手术组(Sham组),2.模型组(UUO组),3.治疗组(血必净干预组,XBJ组)每组各18只,建立UUO模型,术前12小时禁食水,建模过程如下:每组大鼠均以10%水合氯醛(0.4ml/100g)腹腔注射麻醉,消毒后以腹正中线左侧为手术切口,沿腹正中线方向延伸切口,逐层分离,暴露肾脏,沿肾脏下极逐步分离输尿管。Sham组仅游离输尿管,UUO、XBJ组用3-0缝合线从中上段结扎输尿管并剪断,防止逆行感染,然后逐层缝合至皮肤。术后正常饮食及活动。三组大鼠分别于术前1天开始给药,XBJ组腹腔注射血必净注射液4ml(kg/d),Sham组和UUO组腹腔注射同等剂量的生理盐水。三组大鼠分别于手术后第3天、7天、14天时按随机取取6只大鼠,同样进行手术采取梗阻侧肾脏标本:一部分保存于福尔马林中液固定,另外一部分分别利用HE染色、Masson染色法光镜下观察每组肾组织标本的病理变化,均置于-80℃冰箱内保存。采用免疫组织化学法对每组的TGF-β1、p-ERK1/2、α-SMA、Collagen-Ⅲ进行半定量分析其表达水平并记录。实验数据用SPSS21.0统计分析软件进行分析,结果以((?)±s)表示,各组均值采用t检验,率的比较采用χ2检验,P<0.05表示结果有统计学意义。结果:1肾脏组织病理形态观察1.1大体标本Sham组肾组织颜色新鲜,呈红褐色,体积无变化;UUO组肾脏体积增大、皮质变薄,水肿明显,XBJ组肾脏组织颜色、体积改变均轻于UUO组。1.2光镜观察1.2.1 HE染色Sham组:大鼠肾脏组织结构未见异常。UUO组:可见肾间质炎症细胞浸润,肾小管有扩张,上皮细变性坏死,肾间质增宽,并随梗阻时间的延长逐渐加重。XBJ组:发现与同时相UUO组病变相同,但病变程度较UUO组轻。1.2.2 Masson染色Sham组:肾组织结构未见明显异常。第3天UUO、XBJ组出现肾小管轻度扩张,第7天及第14天UUO组:可观察到肾小管扩张、肾间质蓝色胶原纤维堆积,且随梗阻时间延长而加重。XBJ组:与同期UUO组相比,肾间质胶原纤维堆积减少,与Sham组相比仍加重。2免疫组化结果2.1 TGF-β1Sham组:TGF-β1主要在肾小管上皮细胞少量表达,且术后第3、7、14天表达水平无统计学差异(P>0.05)。UUO组:TGF-β1主要在肾小管上皮细胞表达,且在术后第3、7、14天随梗阻时间延长逐渐加重(P<0.05),且高于同时相点Sham组水平(P<0.05)。XBJ组:肾TGF-β1主要在肾小管上皮细胞表达,程度较同时期B组有明显下降(P均<0.05),但仍较同时期Sham组中的严重(P均<0.05)。2.2 p-ERK1/2Sham组:p-ERK1/2主要表达部位肾小管上皮细胞胞核。且在第3、7、14天表达水平无统计学差异(P>0.05)。UUO组:p-ERK1/2主要表达部位肾小管上皮细胞胞核,且在术后第3、7、14天随梗阻时间延长逐渐加重(P<0.05),且高于同时相点Sham组水平(P<0.05)。XBJ组:主要表达部位肾小管上皮细胞胞核,程度较同时期UUO组有明显下降(P均<0.05),但仍较同时期Sham组中的严重(P均<0.05)。2.3α-SMA表达Sham组:α-SMA主要在肾小管上皮细胞及肾间质无明显表达,且术后第3、7、14天表达水平无统计学差异(P>0.05)。UUO组:肾小管上皮细胞中α-SMA表达水平明显增高,且在术后第3、7、14天随梗阻时间延长逐渐加重(P<0.05),且高于同时相点Sham组水平(P<0.05)。XBJ组:肾小管上皮细胞α-SMA表达水平较高,程度较同时期UUO组有明显下降(P均<0.05),但仍较同时期Sham组中的严重(P均<0.05)。2.4 Collagen-ⅢSham组:Collagen-Ⅲ在肾间质及小管上皮细胞正常基础表达,术后第3、7、14天表达水平无明显变化,无统计学意义(P>0.05)。UUO组:肾小管上皮细胞及肾间质中Collagen-Ⅲ表达水平明显增高,且在术后第3、7、14天随梗阻时间延长逐渐加重(P<0.05),且高于同时相点Sham组水平(P<0.05)。XBJ组:肾小管上皮细胞及肾间质中Collagen-Ⅲ表达水平虽有增高,但程度较同时期UUO组有明显下降(P均<0.05),仍较同时期Sham组中的严重(P均<0.05)。结论:1.在UUO模型中,TGF-β1、p-ERK1/2、α-SMA、Collagen-Ⅲ表达随梗阻时间延长逐渐升高,TGF-β1/ERK1/2通路、α-SMA、Collagen-Ⅲ可能参与了肾间质纤维化的进展。2.应用血必净干预后,TGF-β1、p-ERK1/2、α-SMA、Collagen-Ⅲ表达明显减弱,肾间质纤维化程度减轻,说明血必净具有抗纤维化的作用,其部分机制可能是通过抑制TGF-β1/ERK1/2信号通路,下调α-SMA、Collagen-Ⅲ表达水平来实现的。