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大肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，对人类的生命和健康构成了严重的威胁。在全球范围内，大肠癌的年发病人数超过50万，发病率居第三位，在男性中仅次于胃癌和肺癌，在女性中仅次于乳腺癌。近几年，随着我国环境及饮食习惯的改变和人口的老龄化，发病率呈逐年上升的趋势。大肠癌最具特征性的是常发生早期转移，这严重影响大肠癌患者的健康和疗效。因此与大肠癌转移相关的因素已经成为众多学者研究的热点，不仅有利于发现大肠癌转移的分子机理，而且还能为临床诊治、药物筛选及预后判断提供新的依据，具有巨大的临床价值和社会意义。 第一部分 大肠癌细胞的培养和转移能力的相关性研究 【研究目的】 比较不同表达PI3K p85α蛋白的大肠癌细胞株LoVo和SW480之间体外转移能力的差异。 【研究方法】 本课题负责人前期的研究证明PI3K p85α蛋白在大肠癌细胞株LoVo中的表达明显高于SW480，以大肠癌细胞株LoVo和SW480为研究对象，采用异质粘附实验和迁移实验确定两个细胞株之间体外黏附和迁移能力的差异。验证PI3K p85α表达的高低与大肠癌细胞体外转移能力的相关性。 【结果】 1.异质粘附实验显示： 大肠癌细胞株LoVo的黏附能力明显高于大肠癌细胞株SW480。 2.迁移实验显示： 大肠癌细胞株LoVo的迁移能力明显高于大肠癌细胞株SW480。 【结论】 1.PI3K p85α蛋白表达量较高的大肠癌细胞株LoVo的黏附能力高于PI3K p85α蛋白表达量较低的大肠癌细胞株SW480。 2.PI3K p85α蛋白表达量较高的大肠癌细胞株LoVo的迁移能力高于PI3K p85α蛋白表达量较低的大肠癌细胞株SW480。 3.大肠癌细胞的体外黏附能力和迁移能力与PI3K p85α蛋白表达量的高低具有相关性。PI3K p85α蛋白表达量高的体外黏附能力和迁移能力较强。 第二部分 PI3K p85α慢病毒干扰载体的构建及转染 【研究目的】 构建PI3K p85α慢病毒干扰载体，转染大肠癌细胞株LoVo和SW480，建立缺失表达PI3K p85α的大肠癌细胞株LoVo和 SW480。 【研究方法】 采用课题申请人已经证明有效的RNA干扰系列，构建PI3K p85α重组干扰载体并筛选、鉴定及扩增。行慢病毒干扰载体感染。最后用增殖实验及Western-Blot检测PI3K p85α的干扰效果。 【结果】 1.干扰后大肠癌细胞株 LoVo和 SW480的增殖能力较未干扰的细胞株明显减弱。 2.干扰后Western-Blot实验检测大肠癌细胞株 LoVo和SW480中PI3K p85α的表达明显降低。 【结论】 1.成功构建PI3Kp85α慢病毒干扰载体，其能在体外高效转染大肠癌细胞。 2.PI3Kp85α慢病毒干扰载体成功转染大肠癌细胞株LoVo和SW480，建立稳定缺失表达PI3K p85α蛋白的大肠癌细胞株，达到体外细胞实验的要求。 3.靶向PI3Kp85α的RNA干扰技术可以序列特异性地抑制大肠癌细胞株LoVo和SW480中PI3K p85α蛋白的表达，在体外实验中对大肠癌的增殖起到了明显的抑制作用。 第三部分 PI3K p85α表达的变化对大肠癌细胞株LoVo和SW480体外侵袭和迁移的影响。 【研究目的】 通过划痕实验、迁移实验及侵袭实验进一步验证PI3K p85α表达变化对大肠癌细胞株LoVo和SW480体外迁移和侵袭的影响。 【研究方法】 利用慢病毒干扰载体转染成功的大肠癌细胞株LoVo和SW480为实验组，转染空载体的大肠癌细胞株LoVo和SW480及未转染载体的大肠癌细胞株LoVo和SW480为实验对照组。在体外行肿瘤细胞的划痕实验、迁移实验及侵袭实验。研究不同表达PI3K p85α蛋白的细胞株之间的转移能力的差异。 【结果】 1.划痕实验显示： 转染PI3Kp85α干扰载体的大肠癌细胞株LoVo和SW480向划痕中心迁移的距离明显少于阴性转染和未转染的大肠癌细胞株LoVo和SW480。而阴性转染和未转染的大肠癌细胞株LoVo和SW480的向划痕中心迁移的距离无明显差别。 2.迁移实验显示： 转染PI3Kp85α干扰载体的大肠癌细胞株LoVo和SW480的迁移能力明显低于阴性转染和未转染的大肠癌细胞株LoVo和SW480。而阴性转染和未转染的大肠癌细胞株LoVo和SW480的迁移能力无明显差别。 3.侵袭实验显示： 转染PI3Kp85α干扰载体的大肠癌细胞株 LoVo和 SW480的侵袭 Matrigel基底膜能力和迁移能力明显低于阴性转染和未转染的大肠癌细胞株 LoVo和 SW480。而阴性转染和未转染的大肠癌细胞株 LOVO和 SW480的侵袭 Matrigel基底膜能力和迁移能力无明显差别。 【结论】 1.PI3K p85α表达量的高低与大肠癌细胞株LoVo和SW480的迁移能力具有相关性。表达量低的，其迁移能力也较低。 2.PI3K p85α表达量的高低与大肠癌细胞株LoVo和SW480的侵袭能力具有相关性。表达量低的，其侵袭能力也较低。 3.PI3K p85α siRNA转染大肠癌细胞株LoVo和SW480，可抑制其侵袭及转移能力，PI3K p85α可能成为大肠癌基因治疗的靶点。