氮素作为植物生长发育所需的元素,是植物体内蛋白质、磷脂、核酸、辅酶及辅基(NAD+、NADP、FAD)等的必需成分,也是构成叶绿素分子的组分,同时影响植物体内激素的合成及转运。所以,氮素对植物生长发育的影响至关重要。硝酸盐是大多数高等植物的主要氮源,了解土壤中硝酸盐的吸收机制和植物对低氮胁迫的反应,对提高植物氮素吸收和利用效率,减少氮肥施用量等方面具有非常重要的意义。棉花作为一种氮敏感植物常常需增施氮肥来提高产量,但是氮肥施用过多过少均会造成棉花产量的下降,棉农常常因无法确定合适的施氮量而倾向于增施氮肥,这样不仅会造成棉花的贪青晚熟、产量下降,而且未被吸收的氮素随着水土流失更造成环境污染。因此,培育氮高效品种就成为现阶段棉花育种的研究重点。NRT2作为一种以硝酸盐为特异性底物的高亲和性转运蛋白,在可利用的硝酸盐有限时,高亲和性转运系统被激活并发挥主导作用。在拟南芥中已证明NRT2.5是一个高亲和力硝酸盐转运蛋白,在植物响应严重氮缺乏胁迫中发挥重要作用。研究GhNRT2.5基因,有助于了解棉花响应硝酸盐信号的分子机制,阐释该基因在棉花抵抗低氮胁迫中发挥的作用。为此,本论文利用棉花遗传转化手段改变棉花体内NRT2.5含量,探究NRT2.5在棉花低氮胁迫中的作用,主要研究结果如下:1.棉花GhNRT2.5基因的克隆与分析首先,在课题组前期为探究低氮胁迫对不同氮利用效率的棉花品种的转录组数据分析得到了棉花NRT2家族的硝酸盐转运蛋白,发现只有Gohir.D12G148900编码的硝酸盐转运蛋白,在低供氮水平的表达量均高于正常供氮水平。据此,推测棉花中Gohir.D12G148900编码的转运蛋白在棉花响应低氮胁迫或在提高其氮肥利用效率中发挥重要的作用。然后将拟南芥NRT2家族与棉花NRT2家族进化树分析,发现Gohir.D12G148900基因编码蛋白与拟南芥NRT2.5关系最近,因此,将Gohir.D12G148900命名为GhNRT2.5。而后利用蛋白质在线预测网站TMHMM分析了GhNRT2.5基因编码的氨基酸序列发现GhNRT2.5总长度为506个氨基酸,是一个膜结合蛋白,具有10个跨膜结构域。2.GhNRT2.5基因的表达特性及功能分析通过热图预测了GhNRT2.5在棉花茎中表达量最高,其次是叶片和根。随后通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)对棉花各个组织分析表明GhNRT2.5在棉花的叶片和根中的表达量最高,与热图结果稍有差异。通过VIGS沉默GhNRT2.5基因的棉花幼苗发现,注射pTRV2-GhNRT2.5棉花幼苗根和叶中GhNRT2.5基因的表达量均明显低于对照,其表达水平为对照的一半及以下。而且表现出叶片变黄等明显的缺氮表型,测其叶绿素含量均比对照下降,暗示沉默GhNRT2.5基因会导致棉花幼苗对缺氮更为敏感。将棉花在不同供氮水平下处理后发现在短时间(2 d内)低氮供给水平下GhNRT2.5基因的表达量均高于正常供氮水平下的表达量,但在长时间(3 d以上)处理下GhNRT2.5基因表达水平未持续增加,且出现了在正常供氮水平下的表达高于低供氮水平,说明GhNRT2.5基因参与棉花对低氮的短时间响应过程。为了更好地了解GhNRT2.5基因的功能,在烟草中瞬时表达和在拟南芥异源表达GhNRT2.5:GFP融合基因,荧光观察结果表明棉花GhNRT2.5是一个质膜定位的硝酸盐转运蛋白。3.GhNRT2.5基因启动子序列的克隆与表达特性分析为了进一步明确GhNRT2.5基因在棉花生长过程中的调控机制,将棉花GhNRT2.5基因上游调控区2500bp进行克隆获得该基因的启动子(pGhNRT2.5),然后构建其与GUS基因融合的植物表达载体(pGhNRT2.5::GUS),并将其转入拟南芥。对获得的纯合后代GUS染色发现,该启动子主要在拟南芥花药、荚果、腋芽、莲座叶、根等组织器官中表达。根据对GhNRT2.5启动子中的顺式作用元件分析发现有多个与衰老相关的调控元件。因此,外源添加植物脱落酸(ABA)模拟植物衰老过程,发现外源添加ABA的拟南芥幼苗与对照相比在短时间内均在植株生长点染色有差异。说明GhNRT2.5启动子能够响应植物衰老过程。选取长到盛花期的拟南芥植株不同部位的叶片用GUS染液浸染过夜发现拟南芥的莲座叶的染色最深,茎生叶和花序叶染色较浅,说明GhNRT2.5基因在衰老叶片中的表达较为活跃,与GhNRT2.5基因启动子能够响应植物衰老过程这一结果相吻合。为了分析该基因启动子是否受不同供氮水平的诱导特性,将pGhNRT2.5::GUS转基因拟南芥植株在低氮水平和正常供氮水平下处理后GUS染色。根据染色结果所示,相较于正常供氮水平下,拟南芥的侧根在低氮供给水平下染色较深,且主根也有染色。这一结果表明在低氮水平下可诱导GhNRT2.5基因表达。4.GhNRT2.5基因可在棉花低氮胁迫反应中发挥重要作用通过分子手段调控棉花GhNRT2.5基因的表达,构建GhNRT2.5的超量、干扰、基因编辑植物表达载体并进行棉花遗传转化,筛选鉴定出相应的转基因植株。通过对现有的棉花植株观察表型发现发生基因编辑的棉花较超量、干扰两种棉花表现出明显的叶片黄化,选取同时期生长的野生型棉花同一位置的叶片测其叶绿素含量之后发现,发生基因编辑棉花植株叶绿素a、b以及类胡萝卜素的含量均比野生型相比发生了下降。然后对转基因棉花进行了与氮代谢相关酶的活性测定发现,在谷氨酸合成酶、硝态氮以及亚硝酸还原酶中均表现出发生基因编辑的棉花其活性比野生型下降而在超量棉花植株中上升。以上数据显示,降低GhNRT2.5的表达会使叶片中硝酸盐吸收减少、叶绿素合成下降。而且GhNRT2.5能够参与棉花氮同化及转运过程中的关键过程,从而在一定程度上可提高棉花对低氮胁迫的抗逆能力。