适量运动是健康的基础,也是《“健康中国2030”规划纲要》和《健康中国行动(2019—2030年)》对于促进国民健康,减少慢性病发生的内在要求,但不科学的运动与训练、超出自身负荷的过量运动会带来运动伤害。运动医学领域的研究发现,持续高强度运动或训练(尤其是耐力性运动如长跑)常常会诱导以恶心、呕吐、腹痛、腹泻为主要特征的胃肠综合征(gastrointestinal syndrome,GIS)发生,不仅降低运动能力,而且影响运动后体能恢复,其发生主要与肠道屏障功能障碍密切相关,但具体调节机制尚不完全清楚,并缺乏相应的防治措施。近年来免疫学最新研究结果表明肠道区域性免疫调节紊乱与多种疾病的发生发展密切相关,主要表现在肠粘膜上皮间及固有层中多种免疫细胞及其分泌的细胞因子共同参与肠区域免疫稳态的调节及屏障功能的维持,但其在高强度运动诱导GIS发生中的作用和相关机制尚不明确,进一步探索高强度运动诱导GIS发生的区域免疫机制和相应的干预措施尤为关键。由肠上皮细胞和上皮细胞间紧密连接、黏附连接等构成的机械屏障是避免肠源性内毒素血症(endotoxemia)发生的重要结构。近年来免疫学领域研究发现,肠上皮间淋巴细胞(intestinal intraepithelial lymphocytes,IELs)作为肠道粘膜屏障功能维持的重要免疫细胞,通过分泌IL-10、KGF等保护性细胞因子以及IFN-γ、TNF-α等损伤性细胞因子直接调节肠粘膜完整性,其数量变化和细胞功能紊乱在多种肠道屏障功能障碍相关疾病的发生中尤为关键。此外,肠粘膜固有层中的3型固有淋巴样细胞(group 3innate lymphoid cell,ILC3)通过分泌IL-22与肠上皮表面的IL-22R结合调节紧密连接蛋白的表达,从而维持肠道机械屏障功能。既往有“J”型曲线理论、“开窗”理论等认为过高强度运动后会暂时性降低机体免疫力,其免疫相关机制可能是高强度运动诱导GIS发生的关键环节,但IELs、ILC3及IL-22等重要免疫细胞和细胞因子在其中的作用和相关机制尚不明确。我们前期在对比高强度运动前后人群研究中也同样发现,高强度运动显著诱导机体肠道屏障功能障碍,炎症因子TNF-α、IL-10的表达水平也显著改变,因此拟进一步利用动物实验研究其发生机制和新的防治策略。植物性食物的摄入及其健康功效的研究已经成为营养学领域研究的热点,这主要与植物性食物中含有的多种植物化学物有关。二氢杨梅素(dihydromyricetin,DHM)是一种天然多酚类化学物,具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎症、改善糖脂代谢等生物学功效。课题组前期研究发现,DHM可以通过FLCN-FNIP1/AMPK通路调节骨骼肌纤维类型转化,提升高原低氧条件下运动耐力;还可通过PGC-1α-SIRT3-OPA1通路调节线粒体代谢动力学从而改善骨骼肌微损伤。但是,DHM是否能够改善高强度运动导致的GIS尚不清楚。研究表明,芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AhR)是一些肠道免疫细胞如IELs、ILC3的关键核受体转录因子,参与多种细胞因子的免疫调节,而AhR同时也是一些多酚类化合物的天然受体。我们预实验研究发现,DHM能够在体外激活AhR,推测DHM可能作为AhR的天然配体在体内发挥作用,进一步深入研究DHM能否调节肠区域免疫相关的免疫细胞或细胞因子可以为高强度运动诱导GIS防治提供新的膳食营养干预策略以及理论依据。因此本研究提出如下科学假说:定植于肠道的多种免疫细胞及其分泌的相关细胞因子,特别是IELs、ILC3及IL-22可能在高强度运动诱导肠道屏障功能障碍中发挥关键作用;DHM可能通过肠道区域免疫途径调节肠粘膜屏障功能改善高强度运动诱导的GIS。1.研究目的揭示肠区域免疫机制尤其是IELs、ILC3及IL-22等关键免疫细胞及相关细胞因子在高强度运动诱导肠道屏障功能障碍中的作用;明确DHM对高强度运动诱导肠道屏障功能障碍的保护作用,并阐明这一保护作用的区域免疫机制。2.实验方法(1)利用C57BL/6小鼠建立高强度运动模型,首先通过HE染色和透射电镜从大体和超微结构两个层面观察高强度运动对肠道绒毛、上皮细胞、微绒毛等结构的影响。利用分子生物学方法和通透性实验观察其对小鼠肠道屏障功能的损伤以确定模型建立成功。在检测小鼠肠道组织IL-22表达的基础上,进而利用胞内细胞因子染色技术检测高强度运动对小鼠肠粘膜固有层淋巴细胞及CD4+T细胞的IL-22表达水平。随后运用多色流式细胞术对IELs的各个亚群以及肠粘膜固有层ILC3及其亚群比例进行分析。初步阐明肠道区域免疫相关途径在高强度运动导致GIS发生中的作用。(2)进一步利用小鼠高强度运动模型,通过ELISA、HE染色、qRT-PCR、Western blot等方法,研究DHM(100mg/kg·bw)干预两周对高强度运动诱导小鼠肠道屏障功能障碍的改善作用;进而利用多色流式细胞术分析DHM对小鼠小肠IELs数量、表型以及CD8αα+IEL迁移活化标志物表达的影响,并通过胞内细胞因子染色技术检测各组小鼠肠道CD8αα~+IEL的IFN-γ和IL-10表达水平;通过检测AhR活化标志物CYP1A1的表达以及模拟分子对接初步阐明DHM的作用靶点;最终揭示DHM通过肠道区域免疫途径改善高强度运动诱导肠屏障功能障碍的作用及机制。3.主要实验结果和结论(1)高强度运动能够显著诱导小鼠肠道屏障功能障碍以及肠粘膜多种免疫细胞比例失调和细胞因子表达改变。研究结果表明,高强度运动能够降低肠道与维持肠屏障功能密切相关的IL-22表达,增加IFN-γ、TNF-α等的表达,显著改变ILC3(特别是NCR+ILC3亚群)及IELs各亚群细胞比例;(2)DHM干预能够显著改善高强度运动诱导小鼠肠道屏障功能障碍。研究结果表明,DHM能够降低高强度运动导致的肠粘膜炎症、通透性和内毒素血症,增加肠上皮间紧密连接蛋白表达和肠粘膜完整性;(3)DHM干预可能通过免疫相关途径改善高强度运动诱导的小鼠肠道屏障功能障碍。研究结果表明,DHM能够降低高强度运动导致的IELs数量增加和CD8αα+IEL亚群的比例增加,调节关键炎症因子IFN-γ和IL-10水平,上调IL-22表达水平;而上述作用可能与DHM激活AhR受体有关;4.全文结论高强度运动诱导的肠道屏障功能障碍主要与肠区域免疫稳态失调有关,尤其与IELs数量和亚群比例失调、ILC3比例以及IL-22表达水平下降密切相关。DHM干预能够有效改善高强度运动诱导的肠粘膜屏障功能障碍,该作用可能与DHM上调IL-22表达水平、减少IELs细胞数量、调节CD8αα+IEL亚群比例和功能这一新的区域免疫机制密切相关。该研究为阐明高强度运动导致肠道屏障功能损伤的区域免疫紊乱新机制,以及从膳食营养途径寻找干预策略提供了科学依据。