目的当前化石能源的急剧消耗和燃烧造成的环境空气污染问题越发凸出,严重影响人类的生存和发展。而作为“第二代生物能源”的生物燃料,有望解决这类环境问题以及降低对化石能源的依赖。将自然界中丰富的纤维素生物质转化为生物燃料是当前研究热点之一。木聚糖酶属于糖苷水解酶家族成员,是一种将半纤维素分解成单糖的半纤维素酶。因此,木聚糖酶可广泛用于糖和生物乙醇的生产。然而,研究发现木质纤维素经预处理衍生出的多种酚类物质能有效抑制木聚糖酶活性,如单宁酸、肉桂酸、阿魏酸等。另外,愈创木酚和咖啡酸对从日本曲霉粗酶中的木聚糖酶也有明显抑制作用。目前,多数研究主要集中在对木聚糖酶活性的抑制作用上,但有关抑制剂对木聚糖酶的抑制机制及构象变化的研究报道较少。乙酰丁香酮和香草醛均是含有酚羟基结构的酚类物质,可从木质素中提取。既往研究发现乙酰丁香酮和香草醛对纤维素酶的活力有不同程度的抑制作用。但乙酰丁香酮对木聚糖酶的抑制作用尚未被研究,而关于香草醛对该酶的抑制作用的结论则说法不一。本课题拟探究乙酰丁香酮和香草醛对木聚糖酶的抑制作用及机制,有利于我们扩充对酚类物质与木聚糖酶的作用的认识,为提高木聚糖酶活性并继而提高糖和生物乙醇产量提供新思路和理论依据。方法在这项研究中,我们主要采用酶动力学方法研究乙酰丁香酮和香草醛对木聚糖酶活性的影响及机制。主要研究内容如下:(1)研究乙酰丁香酮和香草醛对木聚糖酶的抑制情况和可逆性;(2)分析乙酰丁香酮和香草醛对木聚糖酶的抑制类型;(3)研究乙酰丁香酮和香草醛与木聚糖酶相互作用的动力学过程;(4)荧光光谱法分析乙酰丁香酮和香草醛对木聚糖酶的空间结构和疏水性的影响。结果乙酰丁香酮对木聚糖酶有显著抑制作用,抑制类型表现为可逆且非竞争性抑制(最大抑制率约50%,β=0.0090±0.0009 mM-1)。时间动力学结果表明其对木聚糖酶的抑制遵循快慢两相一级反应的复杂过程。内源荧光和ANS结合荧光分析发现乙酰丁香酮对木聚糖酶活性的抑制,可能与其诱导酶蛋白的区域性结构改变以及疏水区暴露降低有关(KA=6.62×106 M-1,n=1.73±0.028)。香草醛以一种可逆且相对紧密的方式快速抑制木聚糖酶活性,属于非竞争性抑制类型(最大抑制率约51%,β=0.0041±0.0001 mM-1),且其介导的酶活性抑制过程为单相的一级反应。内源荧光和ANS结合荧光分析发现香草醛能诱导木聚糖酶发生空间结构改变和酶疏水性降低(KA=8.26 × 106M-1,n=2.03±0.098)。结论(1)乙酰丁香酮与香草醛均能明显抑制木聚糖酶活性;(2)乙酰丁香酮与香草醛对木聚糖酶的抑制类型均表现为可逆且非竞争性抑制;(3)乙酰丁香酮对木聚糖酶的抑制结合能力强于香草醛;(4)乙酰丁香酮对木聚糖酶的抑制过程表现为复杂的两相一级反应;而香草醛介导的酶活性抑制则无明显动力学变化过程。(5)乙酰丁香酮和香草醛分别诱导木聚糖酶的区域性结构和整体结构改变,且均不引起疏水区暴露。