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研究背景及目的O157:H7是肠出血性大肠杆菌的一个主要血清型(本文简称为O157),感染该菌可使人患腹泻、出血性结肠炎、也可引发溶血性尿毒综合征及血小板减少性紫癜等并发症,严重者可导致死亡。自1982年被确定为致病菌的20多年间,世界各地已发生了多起O157的暴发流行,表明O157的感染已成为一个全球性的公共卫生问题。然而目前缺乏有效的防治方法,研究证实抗生素可促使O157菌释放致死性志贺毒素(Stx),从而使患者并发溶血性尿毒综合症的危险性增加,因此,研制O157疫苗对预防和控制O157感染有着极其重大的意义。EspA(大肠杆菌分泌蛋白A)、IntiminC300(紧密粘附素Intimin C端片段约1/3部分)和Stx2B(志贺毒素2 B亚单位)都是O157重要的保护性抗原。EspA作为O157Ⅲ型分泌系统的重要元件,在O157感染引起的宿主细胞A/E(attaching/effacing)损伤过程中起重要的桥梁作用。人和动物感染O157后,机体可产生高水平的EspA抗体。紧密粘附素(Intimin)介导细菌与肠上皮细胞的紧密粘附,是O157最主要的定植因子,尤其是它的C端约1/3部分(Intimin-C)为胞外功能区,可与相应受体结合,具有良好的免疫原性和免疫保护性。Stx2是O157致溶血性尿毒综合征的一个主要毒素,其中B亚单位(Stx2B)具有细胞结合的特性,表现出良好的免疫原性,而针对Stx2B的单克隆抗体具阻断毒素的作用。减毒沙门氏菌因为能够通过粘附、侵袭、定居在肠道相关淋巴组织,已被证实为有效的粘膜免疫载体工具,可经肠系膜淋巴结到达肝脏、脾脏,进一步有效地刺激机体产生粘膜、细胞和体液免疫应答。特别是近来利用不以抗生素作为选择压力的载体-宿主平衡致死系统构建的减毒沙门氏菌载体疫苗已显示出良好的应用前景。因此本实验利用pYA3149的载体-宿主平衡致死系统表达O157的EspA及其IntiminC300、Stx2B的融合保护性抗原,构建以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的肠出血性大肠杆菌O157:H7疫苗,并通过动物实验观察重组载体疫苗的免疫原性及免疫保护性,为发展新型的O157疫苗提供实验依据。实验结果:1.采用PCR技术扩增获得了579bp的EspA基因、1476bp的EspA-IntiminC300和1767bp的EspA-IntiminC300-Stx2B融合基因,经测序鉴定正确后分别连接到平衡-致死载体pYA3149上,再依次转化大肠杆菌DH5α的asd基因缺失突变株x6097、沙门氏菌中间宿主x3730及终宿主菌x4550。IPTG诱导重组工程菌x4550 (pYA3149- EspA)、X4550(pYA3149-EspA-IntiminC300)及X4550(pYA3149- EspA- Intimin C 300-Stx2B),成功表达了上述三种抗原蛋白,免疫印迹证实所表达蛋白能与相应抗体发生抗原抗体反应。2.对重组减毒伤寒沙门氏菌载体疫苗株进行体外稳定性实验, x4550 (pYA3149-EspA)、X4550(pYA3149-EspA-IntiminC300)及X4550(pYA3149- EspA- Intimin C300-Stx2B)在有选择压力(不含DAP)和无选择压力(含DAP)的条件下传10代后随机挑取100个菌落分别接种于不含DAP的LB平板及含DAP的LB平板上培养,结果无论有无选择压力存在,所挑取的菌落99%均生长,从中随机选出20个菌落抽提质粒,95%的菌落含有重组质粒。表明构建的重组工程菌在体外有较好的遗传稳定性。3.以重组减毒伤寒沙门氏菌载体疫苗口服免疫三次Balb/c小鼠后,各实验组免疫后血清特异性抗体GMT值与免疫前相比均差异显著(p<0.001),与对照组相比也差异显著(p<0.001)。三次口服后再注射重组蛋白加强免疫一次,血清特异性抗体大幅增高(p<0.001)。4.利用肥达氏反应、SS选择培养、PCR、免疫荧光等方法检测,进一步证实重组减毒伤寒沙门氏菌载体疫苗3次口服免疫后能在小鼠脾、Peyer,s结和回肠定植,且能特异表达O157的相关抗原。5.免疫后小鼠以1×109CFU/只剂量的O157全菌液进行攻毒免疫保护实验,结果表明3次口服重组载体疫苗后x4550(pYA3149-EspA)、x4550(pYA3149-EspA–Intimin C300)及x4550(pYA3149-EspA-IntiminC300-Stx2B)组保护率分别为36%、44%和62%,注射重组蛋白加强免疫后保护率分别提高到56%、67%和89%。不经口服只注射蛋白抗原的小鼠,免疫后保护率为0%、11%、11%。结论:1.采用平衡-致死系统分别构建了表达O157:H7 EspA、EspA-IntiminC300及EspA-IntiminC300-Stx2B的重组减毒沙门氏菌载体疫苗株,并且构建的疫苗株无论有无选择压力均能稳定地在体外传代培养。2.构建的针对O157的重组减毒伤寒沙门氏菌载体疫苗表现出良好的免疫原性和免疫反应性。三次口服免疫Balb/c小鼠,重组菌能稳定地定植在小鼠的脾、PP结、回肠等部位,表达O157特异性抗原,刺激机体产生针对O157的特异性抗体,尤其是口服后注射抗原加强免疫组特异性抗体增高显著,能较好地保护小鼠抵抗O157的感染。