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日本乙型脑炎(JapaneseEncephalitis,JE)是一种蚊媒传播的人畜共患病,由乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV)引起。猪感染JEV主要引起母猪繁殖障碍、公猪睾丸炎。目前使用的猪乙型脑炎减毒活疫苗是SA14-14-2株,该毒株属于基因Ⅲ型。但当前流行的JEV中,基因Ⅰ型正逐渐成为猪乙脑流行的主导。因此,研发基因Ⅰ型的猪乙型脑炎减毒活疫苗具有价值。本研究以实验室分离的猪源基因Ⅰ型JEV毒株SCYA201201株为基础研究对象,通过在BHK-21细胞上的连续传代将其致弱,培育乙型脑炎病毒弱毒株,监测不同代次病毒的培养特性、毒力、基因变异,分析病毒致弱分子突变,为SCYA201201株作为弱毒疫苗的研发以及深入研究病毒致弱机理奠定坚实基础。1.猪源乙型脑炎病毒弱毒株的培育将SCYA201201株在BHK-21细胞上连续传代培育,结合低温和常温培养至86代,其中在F37、F77以及F79代进行挑斑纯化病毒。在细胞传代过程中,选择F1、F16、F26、F36、F46、F56、F66、F76、F86代病毒进行病毒滴度、一步生长曲线、半数致死量的测定,结果表明:SCYA201201株通过BHK-21细胞的连续传代,病毒滴度逐渐升高,由F16代病毒的104 71PFU/ml提高到F86代病毒的1010.83PFU/ml;同时随着细胞的连续传代,病毒毒力逐渐减弱,对乳鼠的半数致死量由F1代病毒10-5.68LD50/0.03ml升高到F86代病毒的10-2.88LD50/0.03ml;病毒一步生长曲线结果表明,在接毒后48h～72h收毒,获得滴度最高的病毒。该部分实验证明了猪源JEV野毒株SCYA201201株在BHK-21细胞上连续传代使病毒培养滴度显著升高,同时毒力明显减弱。对F1和F86代病毒分别进行了神经毒力和神经侵袭力的测定。将F1和F86通过脑内注射和腹腔注射分别接种2、3、4、5周龄昆明小鼠,结果显示F86的毒力都明显低于F1代病毒,证明了 BHK-21细胞连续传代培养使猪乙型脑炎病毒SCYA201201株的神经毒力和神经侵袭力明显减弱。另外,对F86代病毒进行免疫原性的测定。将F86代病毒稀释5倍、10倍进行小鼠免疫试验,通过腹腔接种后进行小鼠血清抗体水平测定,经ELISA检测,结果显示两组F86代病毒免疫小鼠后2周都能产生乙脑阳性抗体,在检测小鼠血清的8周时间里,随着免疫时间延长,小鼠抗体水平逐渐升高;其次,对3组免疫毒株的小鼠进行了攻毒保护试验,在免疫2周后进行以强毒株(YA1)50LD50脑内攻毒,稀释5倍的F86代病毒免疫小鼠后保护率为62.5%,稀释10倍的F86代病毒与SA14-14-2株免疫小鼠后保护率为50%。结果显示,F86代病毒具有较好的免疫原性。本研究成功培育了猪源乙型脑炎病毒弱毒株,为进一步研发乙型脑炎弱毒疫苗提供基础。2.猪源乙型脑炎病毒弱毒株致弱分子突变分析(1)E基因序列的分析在 SCYA201201 株培育过程中,选择F1、F16、F26、F36、F46、F56、F66、F76、F86代病毒,对其E基因进行核苷酸序列的测定以及氨基酸推导序列进行比对分析,发现E基因共出现4个核苷酸的有义突变,导致了 4个氨基酸残基的改变,其中E-123、E-451位置氨基酸的突变为回复突变,E-72、E-251位置的氨基酸为适应性突变,稳定突变的两个位点都位于E蛋白的结构域Ⅱ。(2)编码区基因序列的分析在SCYA201201株培育过程中,选择F1、F46、F86代病毒,进行编码区核苷酸序列(基因 C、M、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B 和 NS5)的测定以及对氨基酸推导序列进行比对分析,结果显示:从F1到F86共出现30个核苷酸的突变,导致了 14个氨基酸的改变,这些氨基酸分别分布在结构蛋白C、M、E以及非结构蛋白NS1、NS2B、NS4A、NS5上。同时发现在核苷酸3594位置由C到A碱基的改变,可能影响了 NS1蛋白的茎环结构。本研究从病毒致弱分子突变分析,发现共14个氨基酸的改变,这些核苷酸的改变可能与SCYA201201株培养特性以及毒力减弱有密切相关。