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目的:建立耐氨甲蝶呤(MTX)对映体的A549细胞株模型,观察MTX/A549耐药细胞的生物学特征,侵袭转移能力,探讨表皮生长因子受体(EGFR)在MTX对映体L-(+)-MTX和D-(-)-MTX耐药A549细胞株中的表达及对启动子甲基化状态分析,以期发现不同MTX对映体作用肿瘤细胞而引起肿瘤转移能力差异的机制,为临床合理使用MTX对映体药物减少肿瘤转移提供新的理论依据。 方法:采用浓度递增结合低剂量持续诱导,获得耐受35μmol/L MTX对映体的细胞系,分别命名为L-(+)-MTX/A549、D-(-)-MTX/A549;倒置相差显微镜观察细胞形态的变化;MTT法绘制细胞生长曲线;MTT方法检测L-(+)-MTX/A549和D-(-)-MTX/A549细胞的耐药指数;通过平板划痕实验检测L-(+)-MTX/A549和D-(-)-MTX/A549细胞迁移能力;采用双层软琼脂克隆形成实验检测L-(+)-MTX/A549、D-(-)-MTX/A549细胞的克隆形成率和观察集落的形态;采用RT-PCR方法测定亲本A549细胞、L-(+)-MTX/A549和D-(-)-MTX/A549两种耐药细胞株中EGFR基因表达;采用MSP方法分析EGFR基因启动子甲基化状态。 结果:①采用浓度递增结合低剂量持续诱导的方法,成功建立MTX不同对映体A549细胞的耐药细胞株,L-(+)-MTX/A549、D-(-)-MTX/A549耐药指数分别为6.12的和20.75。②倒置相差显微镜观察耐药细胞株的形态,亲本A549细胞呈梭形生长,大小均一,分布均匀,排列紧密,贴壁牢固。D-(-)-MTX/A549细胞呈梭状生长,与亲本细胞形态接近,粘接明显分散。L-(+)-MTX/A549细胞有部分细胞呈梭形生长,另外一部分细胞呈团生长,粘附相近;③细胞生长曲线显示D-(-)-MTX/A549的增殖略慢于亲本A549细胞,而L-(+)-MTX/A549的增值最慢;④72小时后D-(-)-MTX/A549细胞的迁移能力大于L-(+)-MTX/A549细胞;⑤软琼脂实验发现D-(-)-MTX/A549细胞、L-(+)-MTX/A549细胞和亲本A549细胞的克隆形成率(％)分别为(1.38±0.17)、(1.36±0.13)和(1.37±0.15),差异无统计学意义(P>0.05);⑥亲本A549细胞、L-(+)-MTX/A549细胞均有EGFR mRNA表达,其IDV值分别为(6630±64)、(3697±27),差异有统计学意义(P<0.01)。而的D-(-)-MTX/A549细胞中EGFR基因不表达;⑦MSP的结果显示,亲本A549、D-(-)-MTX/A549和L-(+)-MTX/A549三种细胞中均发生甲基化。 结论:D-(-)-MTX/A549耐药细胞在体外运动、增殖能力均大于L-(+)-MTX耐药细胞,从而说明MTX对映体耐药细胞后细胞的转移力具有手性差异;MTX诱导耐药后细胞株中EGFR mRNA发生变化,且在两种对映体细胞株间具有明显的手性差异,且MTX可能通过改变EGFR基因启动子的甲基化状态,影响EGFR的表达。