目的：(1)探讨UC患者肠黏膜通透性的改变、肠黏膜通透性反映UC患者疾病活动程度的敏感性和肠黏膜通透性改变的MLCK机制。(2)探讨结肠炎小鼠肠黏膜通透性的改变、巴柳氮及MLCK抑制剂对肠黏膜通透性的影响及其MLCK机制。　　方法：　　1.溃疡性结肠炎患者肠黏膜通透性改变及其机制研究　　(1)研究对象　　收集2009年至2011年安徽医科大学第一附属医院消化内科就诊的60例确诊为UC的患者和10例对照者。　　(2)肠黏膜通透性改变的功能研究　　UC患者和对照者测试前1天晚10时起禁食,次日早晨6时空腹排空尿液后,口服乳果糖和甘露醇测试液50ml,口服测试液后禁水1小时,禁食2小时,收集口服乳果糖和甘露醇后6h内尿液标本,防腐处理后,置-80℃保存。采用HPLC-PED方法检测UC患者和对照者口服乳果糖(L)和甘露醇(M)测试液后尿液中L、M含量,计算L/M比值。分析UC患者肠黏膜通透性的功能改变。　　(3)肠黏膜通透性改变的形态学研究　　UC患者和对照者结肠镜检查时,进境至末段回肠,通过活检钳取距回盲瓣5cm处回肠黏膜标本4-6块,分别置于电镜固定液、10％甲醛固定液和液氮中备测。采用透射电镜检测小肠黏膜上皮细胞超微结构改变,分析肠黏膜通透性改变的形态学基础。　　(4)肠黏膜通透性改变与临床指标间相关分析　　UC患者入院时采集血标本分别检测ESR、CRP,同时进行Sutherland DAI评分,分析肠黏膜通透性和ESR、CRP、Sutherland DAI评分之间的相关性,探讨肠黏膜通透性反映UC患者疾病活动程度的敏感性。　　(5)肠黏膜通透性改变的MLCK机制研究　　在研究肠黏膜通透性改变的功能和形态学研究基础上,收集UC患者和对照者回肠末段标本,采用免疫组化、Western blotting和ELISA法检测MLCK活性和表达。分析UC患者肠黏膜通透性的改变与MLCK之间的相关性,探讨肠黏膜通透性的MLCK机制。　　2.巴柳氮对结肠炎小肠肠黏膜通透性的影响及其机制研究　　(1)建立小鼠结肠炎模型和分组给药　　将45只C57BL/6J小鼠用随机方法分成5组:正常对照组、DSS模型组、巴柳氮低剂量组、巴柳氮中剂量组、巴柳氮高剂量组。正常对照组自由饮水, DSS模型组、巴柳氮3个剂量组从实验第1天开始自由饮用5%DSS溶液,共7天。巴柳氮给药剂量根据小鼠体重计算,分别为42 mg/kg、141 mg/kg、423 mg/kg,巴柳氮用蒸馏水溶解后灌胃给药,正常对照组和DSS模型组用等量蒸馏水灌胃,给药时间共7天。　　(2)结肠炎动物模型评估　　每日观察小鼠体重变化、大便性状、观察或用粪便隐血试纸检测大便带血情况,进行DAI评分。实验结束后取结肠进行HE染色评分,结肠匀浆检测MPO、SOD、GSH-Px活性和MDA含量。　　(3)结肠炎小鼠肠黏膜通透性评估　　从肠黏膜通透性改变的功能和形态学基础上同时进行分析,对结肠炎小鼠肠黏膜通透性改变功能研究,采用 Evans蓝方法同时检测小肠黏膜通透性。对结肠炎小鼠肠黏膜通透性改变的形态学研究,采用透射电镜检查小肠黏膜上皮细胞超微结构改变,并采用免疫组化检测E-钙粘蛋白的表达。　　(4)结肠炎小鼠肠黏膜通透性改变的机制　　在评估结肠炎小鼠肠黏膜通透性的基础上,采用 ELISA方法检测小肠匀浆TNF-α和IFN–γ含量。采用免疫组化检测E-钙粘蛋白和VCAM-1蛋白的表达。　　3.MLCK抑制剂对结肠炎小肠肠黏膜通透性的影响及其机制研究　　(1)建立小鼠结肠炎模型和分组给药　　将24只C57BL/6J小鼠用随机方法分成3组:正常对照组、DSS模型组、MLCK抑制剂组。正常对照组自由饮水,DSS模型组、MLCK抑制剂组从实验第1天开始自由饮用5%DSS溶液,共7天。MLCK抑制剂(ML-72 mg/kg)用生理盐水(NS)溶解后腹腔内注射给药,每天2次。正常对照组和DSS模型组用等量NS腹腔内注射。　　(2)结肠炎动物模型评估　　每日观察小鼠体重变化、大便性状、观察或用粪便隐血试纸检测大便带血情况,进行DAI评分。实验结束后取结肠进行HE染色评分,结肠匀浆检测MPO活性、TNF-α、IFN-γ、IL-13和IL-17水平。　　(3)结肠炎小鼠肠黏膜通透性评估　　从肠黏膜通透性改变的功能和形态学基础上同时进行分析,对结肠炎小鼠肠黏膜通透性改变功能研究,采用体内试验 FITC-4000和体外试验 Evans蓝方法同时检测小肠黏膜通透性。对结肠炎小鼠肠黏膜通透性改变的形态学研究,采用透射电镜检查小肠黏膜上皮细胞超微结构改变。　　(4)结肠炎小鼠肠黏膜通透性改变的MLCK机制　　在评估结肠炎小鼠肠黏膜通透性的基础上,采集小肠标本,分别采用Western blotting、免疫组化、ELISA等不同方法检测MLCK表达和活性。分析肠黏膜通透性改变与MLCK表达和活性的关联。　　结果：　　1.溃疡性结肠炎患者肠黏膜通透性改变及其机制研究　　(1) UC患者肠黏膜通透性功能的改变HPLC方法测定结果　　60例UC患者尿中L/M比值为0.081±0.068,明显高于10例对照者尿中L/M比值(0.020±0.002,P<0.05),表明UC患者肠黏膜通透性明显增高。　　(2)UC患者肠黏膜上皮细胞超微结构改变　　与对照组比较,UC患者回肠黏膜绒毛排列不规则,细胞间隙扩大。提示UC患者肠黏膜上皮屏障结构损害。　　(3)UC患者肠黏膜通透性改变与临床指标间相关性分析　　60例患者L/M比值和Sutherland DAI评分之间呈正相关(r=0.634),其中全结肠型UC患者,尤全结肠重度UC患者L/M比值和Sutherland DAI评分之间相关性更高,相关系数分别为0.639、0.703,表明肠黏膜通透性的改变和UC患者疾病活动程度呈一致性,并且病变范围和病情严重程度有关。　　(4)UC患者回肠上皮细胞MLCK蛋白表达和酶活性　　UC患者回肠上皮细胞MLCK蛋白表达及MLCK活性明显高于对照者。UC患者L/M比值和MLCK酶活性之间呈正相关(r=0.846),表明肠黏膜通透性的改变和回肠上皮细胞MLCK酶活性程度一致,提示MLCK可能参与UC患者肠黏膜通透性调节机制。　　2.巴柳氮对结肠炎小肠肠黏膜通透性的影响及其机制研究　　(1)结肠炎小鼠模型的建立　　C57BL/6J小鼠自由饮用5%DSS溶液1周后出现明显体重减轻、便血和腹泻, DAI评分和HI评分增高(P<0.01),同时结肠黏膜MPO活性明显增高(P<0.05)。正常对照组小鼠体重无明显减轻、大便性状正常,DAI评分、HI评分和结肠黏膜MPO活性均无明显增高。　　(2)巴柳氮的抗结肠炎作用　　巴柳氮组小鼠一般情况明显改善,DAI评分和HI评分与DSS模型组小鼠相比,明显降低(P<0.05),结肠黏膜MPO活性减低。DSS模型组小鼠和正常对照组相比, SOD、GSH-Px活性明显降低,MDA含量明显增高(P<0.05)。巴柳氮组SOD、GSH-Px活性增高,MDA含量明显降低(P<0.05)。　　(3)结肠炎小鼠肠黏膜通透性的改变　　DSS模型组小鼠和正常对照组相比,肠组织中Evans蓝含量明显增加(P<0.05),表明结肠炎小鼠肠黏膜通透性增高。透射电镜检查DSS模型组小鼠回肠黏膜上皮细胞形态改变,绒毛变短、萎缩、稀疏、排列极不规则,细胞间连接复合体缩短、变宽,细胞间隙扩大。免疫组化方法发现E-钙粘蛋白表达减少。与DSS模型组相比,巴柳氮组组小鼠肠组织中Evans蓝含量明显降低(P<0.05),表明结肠炎小鼠肠黏膜通透性改善。回肠黏膜上皮细胞形态结构改善,绒毛排列整齐、密集,细胞连接结构清晰、紧密程度增高,E-钙粘蛋白表达增强。　　(4)结肠炎小鼠肠黏膜通透性改变的机制　　DSS模型组小鼠和正常对照组相比,小肠匀浆TNF-α和IFN-γ水平明显增高(P<0.05)。免疫组化方法发现小肠黏膜上皮细胞VCAM-1表达增强。巴柳氮组小肠TNF-α和IFN-γ水平明显降低(P<0.05),小肠黏膜上皮细胞VCAM-1蛋白表达减少。　　3. MLCK抑制剂对结肠炎小肠肠黏膜通透性的影响及其机制研究　　(1)结肠炎小鼠模型的建立　　C57BL/6J小鼠自由饮用5%DSS溶液1周后出现明显体重减轻、便血和腹泻, DAI评分和HI评分增高(P<0.05),同时结肠黏膜MPO活性明显增高(P<0.05)。正常对照组小鼠体重无明显减轻、大便性状正常,DAI评分、HI评分和结肠黏膜MPO活性均无明显增高。　　(2)MLCK抑制剂的抗结肠炎作用　　MLCK抑制剂组小鼠一般情况明显改善,DAI评分和HI评分与DSS模型组小鼠相比,明显降低(P<0.05),结肠黏膜MPO活性减低。DSS模型组小鼠和正常对照组相比,TNF-α、IFN-γ、IL-13和IL-17水平明显增高(P<0.05)。MLCK抑制剂组TNF-α、IFN-γ、IL-13和IL-17水平明显降低(P<0.05)。　　(3)结肠炎小鼠肠黏膜通透性的改变　　DSS模型组小鼠和正常对照组相比,血液中FITC-4000含量和肠组织中Evans蓝含量明显增加(P<0.05),表明结肠炎小鼠肠黏膜通透性增高。透射电镜检查DSS模型组小鼠回肠黏膜上皮细胞形态改变,绒毛变短、稀疏、排列不规则,细胞间连接复合体缩短、变宽,细胞间隙扩大。免疫组化及ELISA方法发现MLCK蛋白表达增强、酶活性增高。与DSS模型组相比,MLCK抑制剂组小鼠血液中FITC-4000含量和肠组织中Evans蓝含量明显降低(P<0.05),表明结肠炎小鼠肠黏膜通透性改善。回肠黏膜上皮细胞形态结构改善,绒毛排列整齐、密集,细胞连接结构清晰、紧密程度增高,MLCK蛋白表达减少、酶活性减低。　　结论　　(1)UC患者和对照者相比,肠黏膜通透性明显增高。采用HPLC方法测定口服乳果糖和甘露醇测试液后尿液中乳果糖/甘露醇排出比值,能正确地反映患者肠黏膜通透性的改变。　　(2)UC患者肠黏膜通透性的改变和UC患者疾病活动程度呈一致性,并且与病变范围和病情严重程度有关。肠黏膜通透性的改变反映UC疾病活动程度的敏感性高于ESR、CRP。　　(3)UC患者肠黏膜通透性的改变和回肠上皮细胞MLCK酶活性程度一致,提示MLCK可能参与UC患者肠黏膜通透性调节机制。　　(4)DSS诱导的结肠炎小鼠临床表现、病理特征与UC相似,是UC发病机制和临床药物研究比较理想的动物模型。　　(5)结肠炎小鼠肠黏膜通透性增高,小肠促炎性细胞因子表达增高,小肠上皮细胞MLCK蛋白表达增强、酶活性增高。　　(6)巴柳氮具有显著的抗结肠炎作用。　　(7)巴柳氮可降低小肠促炎性细胞因子表达,改善结肠炎小鼠肠黏膜通透性。　　(8)MLCK抑制剂可改善结肠炎小鼠临床表现、病理特征和减轻肠道炎症。　　(9)MLCK抑制剂可降低回肠上皮细胞 MLCK活性,改善结肠炎小鼠肠黏膜通透性。