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死亡相关蛋白激酶1(DAPK)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,可由钙调蛋白调节。研究发现DAPK的表达紊乱与数种恶性肿瘤(例如乳腺癌、胰腺癌、宫颈癌、肺癌、肝癌等)的发生发展以及恶性转移有着密切关系。近年来诸多研究指出在膀胱癌患者中DAPK呈现低表达或缺失状态,并且与淋巴结恶性转移相关。但是膀胱癌细胞如何受到DAPK的调控及具体调控机制并不清楚。研究目的:本研究的目的在于探究膀胱癌中DAPK表达的临床意义以及DAPK在膀胱癌细胞行为学上所起到的作用,并且进一步探讨DAPK影响膀胱癌细胞行为学方面的信号通路及分子机制,从而确定DAPK在膀胱癌中的临床价值。研究方法:首先利用数据库分析DAPK的表达情况与患者生存率的关系,同时以慢病毒感染细胞的转染方式,使用Tet-pLKO-shRNA质粒在膀胱癌细胞中建立可经doxycycline诱导敲弱DAPK的稳转细胞系,从而可调控地降低T24以及RT4两株膀胱癌细胞系中DAPK蛋白的表达情况。成功建立的稳转细胞系用于细胞增殖、平板克隆形成实验、划痕愈合实验以及Transwell实验等细胞功能实验,从而检测DAPK蛋白表达量的降低对膀胱癌细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力的影响。此外,针对受影响的细胞功能,基于已有的文献资料,对DAPK的部分下游蛋白进行干扰,从而确定在膀胱癌细胞中DAPK是否通过已报道过的信号通路来影响膀胱癌细胞功能的变化。通过数据库筛选一系列DAPK表达相关性基因,并利用小分子药物互作数据库分析筛选与DAPK表达相关性基因有显著关系的药物,为膀胱癌患者的临床治疗提供参考。实验结果:实验结果显示,DAPK的低表达与膀胱癌患者的低生存率密切相关。同时,膀胱癌细胞功能性实验结果发现DAPK蛋白表达量的降低不会影响T24和RT4细胞的增殖能力、集落形成能力和迁移能力的变化,但是DAPK表达量的降低却会提高T24和RT4细胞的侵袭能力。通过干扰DAPK下游相关蛋白的活性,初步验证了 DAPK是通过integrin来改变膀胱癌细胞侵袭能力的结果。最后我们通过Significant Connection’s Map数据库筛选出潜在的与DAPK表达相关性基因的有显著关系的药物vemurafenib。通过药物实验证实,vemurafenib会在mRNA与蛋白水平提高DAPK的表达量。综合以上实验结果,可得到结论DAPK能够提高膀胱癌患者的生存率。进一步的膀胱癌细胞功能实验发现DAPK可能是通过抑制膀胱癌细胞的侵袭提高膀胱癌患者生存率。此外添加抑制剂干扰DAPK下游蛋白实验发现DAPK是通过integrin来影响膀胱癌细胞的侵袭能力。这一结果表明在膀胱癌中DAPK可能通过调控integrin及其下游蛋白来影响膀胱癌细胞的侵袭能力,从而提高膀胱癌患者生存率。最后DAPK表达相关性基因的筛选以及这些基因的相关小分子药物筛选及验证实验证明TRAK1、ACOX1及UPK2对DAPK的表达具有显著相关性,并且药物实验证明vemurafenib可能通过DAPK相关性基因来影响膀胱癌病人中的DAPK表达量。这些结果表明DAPK是调控膀胱癌细胞侵袭的重要因子,通过调节DAPK的表达来调控膀胱癌细胞的侵袭存在可行性,也为膀胱癌的治疗提供了一个新的药物作用靶点。