研究背景和目的具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,F.nucleatum)是一种常见的牙周致病菌,它在诸如牙周炎、牙龈炎和根尖周炎等多种口腔疾病的发生和发展过程中起作用。F.nucleatum可与口腔中生物膜内各个时期包括初始、早期及晚期定植的细菌发生共聚,是牙菌斑生物膜形成过程中的重要“桥梁”生物。口腔微生物组与全身性疾病之间的相互关系越来越受到重视,有证据表明,F nucleatum是人类感染中最常见的菌种之一,在热带皮肤溃疡、腹膜炎、脓毒性关节炎、细菌性脓肿和肝脓肿、宫内感染、细菌性阴道病、尿路感染、心包炎和心内膜炎以及肺炎和胸膜炎等感染中均能发现F.nucleatum的存在,而且F.nucleatum与结直肠癌的发生发展甚至转移密切相关。此外牙周疾病和口腔癌之间也存在一定的联系,慢性炎症是这两种疾病共同的致病因素。骨是一种可以永久性重塑的钙化组织,这一过程主要受两种细胞的调控,分别是成骨细胞(主导骨基质形成)和破骨细胞(主导骨基质吸收)。同样的,口腔内牙槽骨稳态的维持也与两种细胞之间的动态平衡调节密切相关。牙周病和根尖脓肿是口腔中常见的由细菌感染引起的疾病。菌斑是牙周病发生的起始因素,而牙周病的重要表现之一是牙槽骨的吸收和破坏。在细菌引起的根尖周炎患者中,细菌感染牙髓腔后会排出根管系统,并侵入到根尖周围的组织内,进而引起根尖周组织的感染以及化脓性炎症,导致根尖周组织的破坏。但是在细菌入侵后,其对成骨细胞活性的影响以及成骨能力的影响尚不明确,尤其是关于F.nucleatum对成骨细胞的影响尚未见相关报道,此项工作对了解牙周病和根尖炎的发病机理,新药开发靶点以及对疾病的治疗和预防有重要意义。我们推测细菌可直接侵入牙槽骨并导致骨破坏,并可直接作用于成骨细胞影响其功能,因此我们建立了 长期反复刺激原代大鼠成骨细胞的模型,对受到F.nucleamtu感染后的成骨细胞的一系列生物学活性和功能进行了一系列检测,对相关的分子通路进行了初步验证,并用转录组测序(RNA-sequencing,RNA-seq)方法分析了时间序列下被F.nucleamtu感染的成骨细胞内的转录组变化。总之,本课题的研究以期为进一步理解病原微生物感染抑制骨形成加速骨破坏的机制提供一定的理论支持。材料和方法1.F.nucleatum与大鼠原代成骨细胞的培养鉴定以及F.nucleamtu感染大鼠成骨细胞的体外模型构建F.nucleatum(ATCC 25586)菌株源自山东省口腔组织再生重点实验室。将保存菌株解冻后进行扩增培养,并通过16S rRNA测序进行鉴定,确定培养菌株无杂菌污染。原代成骨细胞采用酶消化联合组织块法取自出生时间在36h内Wistar大鼠的颅顶骨,细胞经培养传代后,采用成骨相关标志物染色法进行鉴定。然后我们收集了对数生长期的F.nucleatum,分别用感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0、10、50、100和200的F.nucleatum感染成骨细胞构建细菌感染细胞的体外模型,并用荧光染色剂观察被F.nucleamtu感染后的细菌和细胞形态。2.F.nucleatum对大鼠原代成骨细胞生物学活性的影响(1)通过细胞计数实验及乙炔基脱氧尿苷(5’-ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU)增殖率检测实验检测不同感染复数的F nucleatum(MOIs=0、10、50、100和200)刺激成骨细胞后对细胞增殖的影响。通过流式细胞仪分析不同感染复数的F.nucleatum对成骨细胞凋亡和细胞复制周期的影响。利用酶联免疫反应(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒检测上述浓度的F.nucleatum刺激成骨细胞后,培养上清液中炎性因子的分泌情况。(2)用上述浓度的F.nucleamtu反复长期刺激成骨细胞,通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性检测试验、细胞内钙含量检测试验以及茜素红染色试验检测F.nucleatum的长期刺激对成骨细胞成骨分化和矿化结节形成能力的影响。同时收集受到不同浓度F.nucleatum刺激7d、14d、21d和28d的细胞,利用实时荧光定量聚合酶链反应(quantity real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blots)技术检测成骨细胞内与细胞成骨分化相关的代表性的基因和蛋白的表达量的变化。(3)本研究的实验均设计有三组生物学重复,使用GraphPad Prism 6.0软件对实验结果进行统计分析。采用单因素ANOVA或双因素ANOVA对多样本均数的差异进行统计分析,并进行Tukey的真实显著差异(HSD)比较检验。通过多重t检验比较两组(对照组和F nucleatum MOI=50实验组)在不同时间点的差异。p值<0.05被认为具有统计学差异。3.时间序列下F.nucleatum刺激大鼠原代成骨细胞后的RNA-seq分析(1)用MOI=50的F.nucleatum刺激成骨细胞,每2d～3d换液时添加相同浓度的F.nucleatum,收集刺激1d、3d、7d、14d、21d和28d的成骨细胞进行RNA-seq测序分析。利用生物信息学技术分析不同时间点的差异表达基因(different expressing genes,DEGs),选择标准为|log2(差异倍数 fold change)|>1,并且具有统计学意义(q值<0.05)。利用韦恩图分析在所有时间点共同表达的差异基因,并利用STRING网站对其进行基因本体论(gene ontology,GO)和京都百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)的富集分析及蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络图的绘制。(2)通过Metascape网站对所有时间点的差异基因进行GO注释,寻找与本实验生物过程相关的差异基因并分析其表达量的变化。利用STEM(短时序表达模式)分析工具对F.nucleatum刺激的不同时间点的成骨细胞内的基因进行表达趋势分析,寻找趋势显著的成骨基因。并利用qRT-PCR技术对筛选出的差异基因进行验证,实验重复3次,采用多重t检验比较两组在不同时间点的差异,p<0.05认为差异有显著性。(3)利用分析软件对转录本信息进行深度挖掘,主要进行SNP和可变剪切类型统计。4.F.nucleatum对大鼠原代成骨细胞影响的机制初探(1)对测序分析中每个测序时间点的差异基因分别进行富集分析,观察F.nucleatum刺激的成骨细胞内通路随时间的改变趋势。(2)挑选AKT/MAPK和NF-κB通路,利用Pathview网站绘制6个时间点通路图。(3)用MOI=50的F.nucleatum刺激成骨细胞,分别收集刺激0min、5min、15min、30min、60min和120min内的6个时间点的细胞提取蛋白,并通过Western blots技术检测参与上述信号通路的相关蛋白在细菌刺激后随时间的变化,实验重复3次,采用多重t检验比较两组在不同时间点的差异,p<0.05认为差异有显著性。研究结果1.F.nucleatum与大鼠原代成骨细胞的培养鉴定以及F.nucleatum感染大鼠成骨细胞后共培养的体外模型构建经PCR和 16S rRNA鉴定扩增培养的F.nucleamtu为Fusobacterium nucleatum ATCC 25586株。F.nucleamtu细菌悬液在BHI固体培养基上划线,经厌氧培养4d～5d后,在平板上出现散在分布的单菌落,形态较小,有臭鸡蛋气味。其对数生长期为培养后的16h至28h。培养的原代细胞经成骨相关标志染色[I型胶原(Collagen type I,Col-1)染色、ALP染色和von Kossa染色]鉴定后显示细胞具有成骨能力,且纯度较高。采用MOI为0、10、50、100和200的F.nucleatum刺激成骨细胞可以实现长期共培养。细胞骨架染色显示对照组细胞胞质胞浆骨架丰满,细胞形状较规则,呈三角形或多边形。而F.nucleatum刺激成骨细胞后可附着在细胞表面或进入细胞内,细胞形态发生改变,胞质紧缩,形态扁长,细胞之间邻接杂乱。2.F.ntucleaum对大鼠原代成骨细胞生物学活性的影响(1)细胞计数法和EdU检测试验结果显示F.nucleamtu显著抑制了细胞的增殖,且随F.nucleatum刺激时间的延长和菌浓度的升高而更显著,具有一定程度上的时间和浓度的依赖性。细胞凋亡流式细胞仪分析结果显示在刺激24h内低浓度(MOI=10)的F.nucleatum对细胞凋亡的影响不显著,但是随着F.nucleatum浓度升高,正常细胞的比例逐渐降低,但是处在凋亡晚期阶段和所有凋亡时期(包括早期和晚期)阶段的细胞逐渐增多。通过流式分析检测的细胞周期结果表明F.nucleatum主要阻断成骨细胞进入G2/M期,抑制其增殖。F.nucleatum刺激成骨细胞后,培养上清中 Interleukin(IL)-6 和 Tumor necrosis factor(TNF)-α 的分泌量显著增加。qRT-PCR结果显示Caspase-8在细菌刺激后的第6h后显著升高并持续到第48h,而72h时Caspase-8的表达量有了显著降低。相反的,Bcl-2的表达量在48h之前较低,第72h时显著升高;Rankl的表达量从第6h开始升高并持续到72h。(2)不同浓度的F.nucleatum刺激成骨细胞3d、7d和14d均明显抑制了细胞ALP的活性,第21d钙含量检测结果表明加菌组钙含量明显减少。第21d和28d的茜素红染色结果表明F.nucleamtu显著抑制矿化结节的形成和钙盐的沉积。在F.nucleatum刺激后的7d、14d、21d和28d,成骨细胞内与成骨功能相关的基因(如Alp1、Runx2、Col-1、Opg、Bsp、Osx 和Ocn)和蛋白(如 ALP、RUNX2、COL-1、OPG、BSP和OSX)的表达明显减少,而RANKL明显增加。3.时间序列下F.nucleatum刺激大鼠原代成骨细胞后的RNA-seq分析(1)对所有样本及每个时间点样本的主成分分析表明,对照组和被F.nucleatum感染组的样本均明显分开。随着细菌刺激时间的增加,样本间的相关性系数逐渐减少。转录组分析得出分别有1138、1122、1446、1039、1382和1048个差异转录本在第1d、3d、7d、14d、21d和28d差异表达;其中有235个差异基因在所有时间点均差异表达。对这些基因进行富集分析,结果主要集中在TNF signaling pathway、IL-17 signaling pathway、immune system process 和 inflammatory response等炎症和免疫相关的路径。PPI互作网络分析结果表明Il-6、Vcam1、Tlr2、Csflr、Cxcl1、C3、Thbs1和Socs3这些基因与其他基因的作用更密切,可能起着关键调控作用。(2)对F.nucleamtu刺激的实验组的转录组数据进行了 STEM分析得到趋势显著的基因8042个,将其与成骨相关的差异基因取交集得到成骨相关趋势显著的差异基因133个,这些基因主要富集在多条与癌症相关的通路上。根据表达趋势得到表达量呈持续上升/下降的成骨相关核心差异基因8个(Cyp1b1、Mnda、Comp、Phex、Mmp3、Nfkb2、Fbln5和Tnfrsf1b),qRT-PCR 对这些基因的验证结果与转录组结果基本一致。(3)对转录本数据进行深度分析,在统计的SNP突变类型中,F.nucleatum的刺激均导致实验组突变频数的增加。TSS和TTS数量在统计的所有可变剪切类型中最多。4.F.nucleatum对大鼠原代成骨细胞影响的机制初探(1)分别对6个时间点的DEGs进行KEGG富集分析,在所有的时间点均被激活的通路包括 PI3K-AKT signaling pathway、osteoclast differentiation、JAK-STAT signaling pathway和TNF signaling pathway等。此外有多条与感染和炎症相关的通路在F.nucleatum感染的初期被激活,而多条与细胞代谢相关的通路如Phospholipase D signaling pathway、Drug metabolism-cytochrome P450 和 Arginine and proline metabolism等在感染的后期激活。(2)通过对MAPK和NF-κB通路的Pathview通路图分析发现在F.nucleatum感染的不同时间段,多个基因的表达发生了改变。Western blots蛋白检测结果证明在F.nucleatum刺激后的120min内AKT/P38和JNK以及NF-κB的通路蛋白被激活。研究结论1.本实验构建了F.nucleatmu与大鼠原代成骨细胞共培养的体外模型。2.F.nucleatum可显著促进成骨细胞凋亡,抑制其增殖,并具有浓度和时间依赖性;而且其主要通过阻断细胞进入G2/M期抑制成骨细胞复制周期。而且F.nucleatum可促进炎性因子的分泌,并显著抑制成骨细胞的成骨分化和矿化。3.RNA-seq分析发现差异表达的共同基因大部分与炎症相关并富集于TNF信号通路和细胞因子相关的通路上;在F.nucleatum抑制成骨细胞分化的过程中激活了多条与癌症相关的通路。4.在F.nucleamtu感染初期主要激活了与感染和炎症相关的通路,但是随着刺激时间的延长,多条与细胞代谢相关的通路被激活。AKT/P38/JNK和NF-κB通路在F.nucleatum感染成骨细胞的初始阶段即被激活。