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一、研究背景冠状动脉钙化已成为影响冠心病治疗效果的关键因素与制约因素之一。临床上,慢性肾衰竭患者的冠脉钙化多发生于以平滑肌细胞为主的中膜,而对于不合并肾衰竭的冠心病患者,由于粥样斑块的存在,钙化则更常见于内膜。近年来,血清甲状旁腺素(PTH)对血管钙化的影响已成为研究热点。然而这些研究大多集中在慢性肾病患者中,对于非肾衰竭患者,探讨两者相关性的研究报道不多。既往基础研究表明,PTH可促进血管平滑肌细胞钙化的发生。血管内皮细胞中富含NOTCH蛋白,其胞内段可与IKK相互作用、活化NF-κB,从而促发炎症反应;另一方面,NF-κB活化还可引起Caspase3(CASP3)的表达继而导致凋亡的发生。基于上述研究结果,我们推测NOTCH1/IKK/CASP3信号通路在血管内皮细胞钙化过程中发挥了调控作用。而PTH能否通过NOTCH1/IKK/CASP3这一信号通路促进血管内皮凋亡及钙化,目前未有相关报道。二、目的1、评估非肾衰竭患者PTH水平与冠状动脉钙化的相关性。2、探讨PTH通过NOTCH1/IKK/CASP3信号通路调控HUVECs凋亡、钙化的具体机制。三、方法(一)研究人群回顾性分析接受冠状动脉CTA检查的非肾衰竭患者共157例。按照冠状动脉钙化Agatston积分(CACS)将入选患者分为钙化组(CACS>0)和对照组(CACS=0)。两组间差异比较采用独立样本的t检验。以ROC曲线、反应变量为二分类的Logistic回归分析模型评估PTH对冠状动脉钙化的预测价值及两者之间的独立联系。(二)实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)HUVECs RNA的提取则按照Trizol常规方法,使用特定的引物进行反转录。qRT-PCR 按照 Takara TB Green Premix 的标准步骤执行,并采用 LightCycler(?)480 System进行扩增。选取GAPDH作为参照物并计算ΔCt值,采用2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达水平。(三)蛋白免疫印迹检测(Western blot)HUVECs样品使用RIPA裂解液提取蛋白,定量后加入4×NuPAGETM LDS Sample Buffer。选用 SurePAGETM 4-12%梯度预制胶,常规 80V-100V 电泳,100V、2 h湿转法转膜。5%脱脂牛奶封闭后,孵育一抗4℃过夜。TBST洗涤3次后,室温下避光孵育二抗1 h。采用ImageQuant LAS 4000 series快速化学光成像系统检测分析蛋白条带。(四)流式细胞术检测取5-10×104个细胞,离心后加入200μl Annexin V-FITC结合液重悬细胞,室温避光孵育10 min,以200g离心5 min后加入190 μl Annexin V-FITC结合液重悬细胞,加入10μl碘化丙啶染色液混匀后进行流式细胞仪检测。(五)细胞转染以Opti-MEM培养液125μl加入Lipofectamine(?)3000试剂3.75μl进行稀释,同时以Opti-MEM培养液125μl加入2500ng质粒DNA和5μl P3000TM试剂或50pmol的siRNA(不含P3000TM)进行稀释,将两份液体混合,于室温下孵育10-15min制备成DNA-脂质体复合物,将最终复合物加入细胞培养液中,于37℃孵育箱中培养2天。(六)统计学分析所有资料采用SPSS18.0软件包进行统计分析。计量资料以平均数±标准差表示,每组实验数据至少重复3次。P<0.05认为差异有统计学意义。四、结果(一)非肾衰竭患者血清PTH水平与冠状动脉钙化的相关性1、钙化组患者的血清PTH水平较对照组显著升高(P<0.05),提示血清PTH水平与是否存在冠状动脉钙化具有显著相关性。2、偏相关分析结果显示钙化组患者PTH水平与CACS之间非线性相关(P>0.05),提示血清PTH水平与冠状动脉钙化的严重程度无明显相关。3、ROC曲线提示血清PTH水平≥31.05pg/ml是预测冠状动脉钙化的最佳切割点。4、反应变量为二分类的Logistic回归分析结果显示血清PTH水平是冠状动脉钙化的独立预测因子(OR=1.050,95%CI 1.027～1.074),P<0.001。(二)PTH在体外显著促进HUVECs钙化和凋亡人重组PTH以10-8mmol/L、10-7mmol/L两个浓度诱导HUVECs钙化,于诱导后0-5天分别收取细胞进行检测。qRT-PCR结果表明,10-7mmol/L浓度时BMP2、BMP4的mRNA表达水平显著高于10-8mmol/L浓度时(P<0.05);从时间上看,PTH诱导细胞的前3天,BMP2、BMP4的表达水平逐渐升高,于第3天时达到峰值,第4、5天时开始下降。进一步行qRT-PCR及Western blot检测验证均显示,以10-7mmol/L的PTH处理HUVECs 3天后,细胞中BMP2、BMP4、RUNX2的mRNA及蛋白表达水平均显著高于对照组(P<0.05),证实体外PTH干预可以显著促进HUVECs的钙化。流式细胞结果显示,PTH处理3天后HUVECs发生了明显的凋亡,提示细胞钙化与凋亡有关。(三)PTH诱导HUVECs后上调NOTCH1/IKK/CASP3的表达PTH以10-7mmol/L浓度诱导HUVECs3天后,qRT-PCR结果显示,钙化下游通路信号分子NOTCH1、IKK-α、IKK-β、CASP3的mRNA表达均较对照组显著升高(P<0.05)。Western blot 检测也显示,与对照组相比,NOTCH1、IKK-α、IKK-β 及CASP3的蛋白表达同样显著增加。(四)过表达NOTCH1促进PTH诱导的HUVECs钙化我们以NOTCH1过表达质粒转染HUVECs,定量PCR结果表明,在同样条件PTH诱导后,NOTCH1过表达质粒显著升高了细胞中NOTCPH1的mRNA水平(P<0.05)。与此对应地,钙化指标BMP4、BMP2、RUNX2以及下游通路信号分子IKK-α、IKK-β及CASP3的mRNA表达水平均较对照组显著上调(P<0.05)。同时,Western blot 结果也显示,NOTCH1 过表达后 BMP4、BMP2、RUNX2、IKK-α、IKK-β及CASP3的蛋白表达水平也较对照组显著升高(P<0.05)。(五)敲低NOTCH1抑制PTH诱导的HUVECs钙化我们进一步以NOTCH1敲低的小干扰RNA(siRNA)转染HUVECs,定量PCR验证NOTCH1的mRNA表达较对照组显著下降(P<0.05)。进一步的定量PCR及Western blot检测结果显示,在相同条件PTH诱导HUVECs后,NOTCHl敲低的细胞内 BMP4、BMP2、RUNX2、IKK-α、IKK-β及CASP3的mRNA及蛋白表达均较对照组显著下调(P<0.05),进一步提示PTH通过NOTCH1/IKK/CASP3信号通路促进HUVECs钙化的发生。五、结论1.血清PTH水平与非肾衰竭患者冠状动脉钙化的发生存在相关性,可作为预测冠状动脉钙化的可靠指标。2.重组PTH能够诱导体外培养的HUVECs发生钙化及凋亡,并呈现时间和剂量相关性。3.PTH可通过NOTCH1/IKK/CASP3信号通路促进HUVECs发生钙化。