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目的:研究如何使视网膜神经细胞避免损伤或死亡即神经保护,是眼科学基础和临床研究的重要领域。近年来发现促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)对中枢神经系统的损伤后的生存、修复及预后有明显保护作用。本实验建立新生大鼠视网膜神经元细胞原代混合培养体系和Müller细胞传代培养体系,分析EPO及EPO受体在正常视网膜神经元细胞以及低氧诱导时的表达,观察缺氧损伤对培养的视网膜神经元的影响,并探索EPO对神经元损伤的保护作用及机制,为EPO在视网膜疾病中的应用奠定理论基础。 方法:将Wistar乳鼠视网膜通过胰蛋白酶+依地酸(EDTA)消化,制成视网膜单细胞悬液,建立一种稳定、可靠的视网膜神经元体外培养体外培养的方法,并用免疫细胞化学技术对视网膜神经元进行鉴定。低浓度氯化钴预处理对视网膜神经元进行低氧预适应,之后制作细胞急性缺氧模型。MTT检测评价视网膜神经元急性缺氧损伤和低氧预适应后细胞的活力改变。采用反转录-PCR(RT-PCR法)、免疫细胞化学方法检测EPO及EPO受体在正常视网膜神经元细胞以及低氧诱导时的表达;从细胞形态学、LDH释放量等形态学和生化指标,观察不同浓度rhEPO预处理对视网膜缺氧损伤的保护作用。TUNEL染色检测视网膜神经元的凋亡,并进行形态学观察和对照。此外,采用机械震荡、吹打法培养和传代视网膜Müller细胞,3～4代的细胞进行神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色,对缺氧条件下视网膜Müller细胞EPO mRNA和蛋白的表达变化进行了检测。 结果:在多聚赖氨酸上培养的视网膜神经元免疫细胞化学染色显示,培养的细胞大多数抗NF抗体反应阳性,NF阳性神经元所占总数神经元的90%以上。体外培养的正常视网膜神经元有EPOR的表达。低氧预适应后经半定量RT-PCR分析,EPO基因表达在1h达最高峰,以后随时间的延长迅速下降,6h下降到接近正常的水平;而EPOR的表达在2h达到最高峰,约为正常对照组的4-5倍,以后虽然出现下降趋势,但仍一直维持较高水平,提示低氧预适应后可上调神经元EPO、EPOR表达,这可能是机体发生内源性视网膜保护的机制之一。同时,证实了外源性应用重组人促红细胞生成素(rhEPO)预处理对神经元的缺氧损伤具有保护作用,在损伤前加入浓度在2.5-40U/ml的rhEPO均可有效抑制LDH释放(P<0.05),而且具有浓度和