实验小鼠作为一种研究工具以来,已经有多达数千种的封闭群、近交系、同类系、重组近交系和突变系等品系。实验小鼠变异进化的速度很快,而在性状上并不表现出来。随着生物医学的发展,无论是学术界还是产业界,对实验动物质量的要求越来越高,因而对实验动物质量的遗传监测方法也提出了更高的要求。目前,中国实验动物遗传质量控制的一些相关标准的遗传监测局限在免疫标记和生化标记等表型检测方法,对于准确、全面地反映实验动物的遗传概貌存在不足,此外,国际实验动物协会建议的实验动物遗传质量程序即为DNA检测方法(http://www.iclas.org/),因此采用DNA标记检测技术来测定小鼠各品系的遗传背景已成趋势。2002年,国际小鼠基因组测序联盟完成了经典实验室品系C57BL/6J(B6)的全测序。同年,Celera公司也完成了另外三个近交系的全序列草图。随后,更多小鼠品系相继被重测序。测序结果表明,实验小鼠基因组三分之二的区域存在着低密度的SNP(0.5个/10kb),而高密度SNP(40个/10kb)则覆盖了其余的三分之一区域。由于SNP数量庞大,高通量的基因分型能降低成本,故世界著名的实验动物公司都已使用SNP遗传标记进行遗传检测。方法本文利用可移植性极高的连接酶SNP分型技术,以常见近交系小鼠为研究对象,选取了 21条染色体上的48个SNP位点,分成4组,每组12个SNP位点。针对这些位点分别设计引物和探针,条件优化后建立了四组多重 PCR-LDR(Polymerase chain reaction and ligase detection reaction,PCR-LDR)分型方案。近交系小鼠的DNA选取小鼠尾尖,并使用基因组DNA小量快速提取试剂盒提取。随后四组多重PCR扩增,产物采用2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。再以PCR产物为模板进行多重LDR连接反应,产物采用标准6%变性测序PAGE胶进行电泳。最后使用GeneScanTM 672来收集数据并用Genemapper来进行基因分型。结果四组多重PCR体系最佳退火温度均为56℃。该体系对10个常见近交系小鼠样本的检测结果显示,有34个SNP位点的数据与NCBI数据库中信息完全一致,并补充了 NCBI中部分品系缺少的信息;2个SNP位点没有信息;11个SNP位点的部分数据与NCBI中信息不符,经测序验证与分型结果一致;还有1个SNP位点在近交系BALB/c和FVB中表现杂合,经测序验证后表明为纯合子。本实验对10个近交系小鼠的3批样本(共66个)进行了检测,结果显示,不同来源的相同品系SNP状态完全一致。在这3批样本中47个SNP位点全出的概率为13.6%,46个SNP位点全出的概率为36.4%,45个SNP位点全出的概率为90.9%,44个SNP位点全出的概率为100%。十个品系间两两进行位点差异比较(共45对),最大差异位点数为29个,最小位点差异数7个;平均差异位点数个数为19,差异位点数中值为20。第一二三组能独立鉴别常见近交系小鼠,第四组除C3H和CBA两个品系,可独立鉴别近交系小鼠。由此可见48个SNP位点在这十个常见近交系小鼠品系中的鉴定效率较高。以上结果表明,PCR-LDR分型方案是一种准确、快捷、高效的基因分型方案,可用于遗传质量检测和品系鉴定。