目的:建立不同程度视神经损伤动物模型,观察其损伤后电生理的变化、组织形态学的改变和自然转归,采用局部玻璃体腔注射重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin,rhEPO),观察其对中重度钳夹伤后视神经的修复作用。并检测半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、神经生长相关蛋白-43(growth associated protein43,GAP-43)、髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein,Mbp)的表达,探讨rhEPO对视神经损伤的修复机制。方法:(1)100只健康级成年Wistar大鼠随机分为四组,空白对照组、轻度损伤组、中度损伤组、重度损伤组,每组25只大鼠。以显微血管夹于球后1-2mm处垂直钳夹视神经,时间分别为2s、15s、30s,制作轻、中、重度视神经损伤模型,空白对照组只暴露不钳夹视神经。如果大鼠伤眼瞳孔散大,直接对光反射消失,间接对光反射存在,视网膜血管无出血或梗塞,伤后5min内血流完全恢复可纳入实验。1h后行闪光视觉诱发电位(flash visual evoked potential,FVEP)检查,损伤眼波形下降或消失,对照眼波形正常视为造模成功。分别于损伤后1d、4d、7d、14d、28d行FVEP检查后处死大鼠,取实验眼及正常的视神经及视网膜做病理切片,进行HE染色,光镜下观察形态学的改变,并分析不同损伤组的FVEP的变化。(2)80只健康级成年wistar大鼠,随机分为4组,中度损伤对照组、重度损伤对照组、中度损伤治疗组、重度损伤治疗组,每组20只大鼠,成功建立视神经损伤模型后,治疗组给予玻璃体腔注射rhEPO 6ul(60IU),而损伤对照组给予生理盐水6ul。各组分别于4d、7d、14d、28d行FVEP检查后处死大鼠,取实验眼及正常眼的视神经做病理切片,进行HE染色。(3)取中度损伤对照组、重度损伤对照组、中度损伤治疗组、重度损伤治疗组的视神经及正常视神经的病理切片,进行免疫组化染色,观察视神经Caspase-3、GAP-43、Mbp的表达,并做半定量分析及组间的比较。结果:(1)FVEP:对照组与正常大鼠FVEP的潜伏期及波幅相比较,各时间点P﹥0.05,无统计学意义。与对照组相比,各组损伤后1h,P2波潜伏期明显延长,波幅明显降低,差别有统计学意义(P<0.05)。除轻度和中度损伤组损伤后1小时潜伏期无差异外,在损伤后1h和1d各不同程度损伤组组间的潜伏期及波幅均有明显差异(P<0.05),随损伤程度的加重,潜伏期延长,波幅降低。轻度损伤组于损伤后第1天基本恢复正常;中度损伤组在14天内随时间增加潜伏期继续延长,波幅继续降低,于14天后趋于稳定。重度损伤组于第4天波形熄灭。视神经HE染色:在纵切面上,正常与对照组视神经纤维平行排列,密集规则,染色均匀,散在少量神经胶质细胞。轻度损伤组损伤后第1天视神经纤维排列规则,染色均匀,轻度水肿,胶质细胞胞浆均质,形态大小均一。4天,仍有轻度的水肿,较第1天改变不明显。第7天较第1天及第4天明显减轻,第14、28天形态基本正常。中度损伤组损伤后第1天视神经纤维水肿,散在空泡样变性,可见炎性细胞浸润。第4天神经纤维排列紊乱,结构疏松,空泡样变性扩大,第7天可见炎性细胞浸润增多,14天至28天可见坏死灶,少部分纤维断裂不连续,细胞核碎裂甚至细胞溶解、消失,并可见胶质细胞增生。重度损伤组损伤后第1天即出现纤维排列紊乱,纤维束不连续,部分纤维断裂坏死,大量炎性细胞浸润,随病程进展逐渐加重,并出现坏死灶,部分神经纤维束结构消失,28天基本无正常结构。视网膜HE染色:正常与对照组大鼠视网膜结构清晰,视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)单层排列、大小不一、较整齐,呈圆形或椭圆形,细胞密集、胞核清晰、较大,染色较浓。轻度损伤组损伤后1天及4天,视网膜轻度水肿,改变轻微,各层清晰,RGCs排列整齐,7天、14天、28天与对照组视网膜几乎无差异。中度损伤组损伤后1天即出现视网膜水肿增厚,RGCs排列不规则,细胞染色不均,随病程进展逐渐加重,细胞核碎裂固缩,至28天时RGCs明显减少,内外核细胞数量明显减少。重度损伤组较中度损伤病变更明显,至损伤后28天时视网膜明显萎缩变薄,失去正常结构。(2)FVEP:中度损伤对照组与中度损伤组相比,P2波潜伏期和波幅在4天、7天、14天、28天无明显差别,差异无统计学意义(P>0.05)。中度损伤治疗组FVEP的P2波潜伏期在4天、7天、14天、28天均较中度损伤对照组缩短,波幅升高,差异有统计学意义(P﹤0.05)。重度损伤治疗组与重度损伤对照组、重度损伤对照组与重度损伤组之间均无变化,4天、7天、14天、28天均引不出波形。视神经HE染色:中度损伤对照组与中度损伤组无明显差别。中度损伤治疗组的视神经与中度损伤对照组相比,治疗组4天及7天仍然有神经纤维的水肿,炎性细胞的浸润,但14天和28天,坏死灶及神经纤维断裂减少。重度损伤对照组与重度损伤组无明显差别。重度损伤治疗组与重度损伤对照组相比,治疗组4天、7天、14天、28天均无无明显变化。(3)Caspase-3在损伤视神经的表达:Caspase-3在正常视神经无明显表达,中度和重度损伤对照组视神经在第4天表达增强,第7天达高峰,之后逐渐回落,至14天、28天仍高于正常水平。Caspase-3在重度损伤对照组各时间点表达明显高于中度损伤对照组,差异有统计学意义(P﹤0.05)。GAP-43在损伤视神经的表达:GAP-43在正常视神经几乎无表达,中度和重度损伤对照组的视神经第4天表达明显,在第7天达高峰,之后逐渐回落,至28天仍高于正常水平。中重度损伤对照组各时间点视神经GAP-43阳性细胞数未见明显差异(P>0.05)。Mbp在损伤视神经的表达:Mbp在正常视神经高度表达,中度损伤对照组在第4天无明显减少,第7天Mbp开始表达减少,14天更少,之后趋于平稳;重度损伤对照组第4天至14天,Mbp表达逐渐减少,之后趋于平稳。各时间点重度损伤对照组的Mbp明显少于中度损伤对照组,差异有统计学意义(P﹤0.05)。(4)rhEPO对损伤视神经Caspase-3表达的影响:中度、重度损伤治疗组的视神经与中度、重度损伤对照组相比,在4天、7天、14天、28天Caspase-3的表达明显降低,半定量分析阳性细胞数明显减少,差异有统计学意义(P﹤0.05)。rhEPO对损伤视神经GAP-43表达的影响:中度损伤治疗组的视神经与中度损伤对照组相比,在4天、7天、14天、28天GAP-43的表达明显升高,半定量分析阳性细胞数明显升高,差异有统计学意义(P﹤0.05)。重度损伤治疗组的视神经与重度损伤对照组相比,在4天、7天、14天、28天GAP-43的表达无明显变化,半定量分析阳性细胞数与损伤对照组无差异(P>0.05)。rhEPO对损伤视神经Mbp表达的影响:中度损伤治疗组的视神经与中度损伤对照组相比,在4天时表达无明显变化,半定量分析阳性细胞数无明显差异(P>0.05)。7天、14天、28天Mbp的表达明显升高,半定量分析阳性细胞数明显增多,差异有统计学意义(P﹤0.05)。重度损伤治疗组的视神经与重度损伤对照组相比,4天、7天、14天、28天Mbp的表达无明显变化,半定量分析阳性细胞数无明显差异(P>0.05)。结论:(1)轻度视神经损伤可自行修复,中度以上损伤如不及时干预可能会发展为不可逆病变。(2)凋亡蛋白酶Caspase-3的表达水平与损伤程度密切相关,损伤程度越重其表达越高;视神经损伤后神经生长相关蛋白GAP-43表达升高来促进机体的自我修复,但不能随着损伤强度的增加无限制的表达升高;Mbp的表达水平与损伤程度密切相关,损伤程度越重其表达越少,在一定程度上反应病情的轻重及预后。(3)rhEPO对中度损伤视神经的修复有促进作用,能改善其视功能,可能的机制是抑制Caspase-3的表达并提高GAP-43、Mbp的表达,促进轴突和髓鞘的再生。(4)rhEPO对重度损伤的视神经修复作用不明显。