胶质瘤是最棘手的难治性肿瘤之一,尽管神经外科手术、放疗和化疗的发展对胶质瘤的治疗起了重要的推动作用,但疗效并不理想,预后仍然不良。尤其是恶性胶质瘤(GBM),因其高增殖及侵袭性生物学特性,虽经以手术为主联合放射及化学治疗,但预后并没有得到明显改善.平均存活时间只有12-15个月,其中多形性胶质母细胞瘤(glioblastomamultiforme, GBM)患者,尤其是老年患者,生存期不足1年。如何控制胶质瘤的恶性增殖和侵袭是目前研究的焦点。目前已认识到,胶质瘤是一种多基因异常疾病,分子发生机制复杂,涉及多种细胞信号通路中细胞因子的异常表达。因此寻找导致胶质瘤发病相关的基因,深入了解胶质瘤的致病机理,进一步开拓胶质瘤治疗的新策略和靶点,成为胶质瘤研究领域的一项重要内容。近年来,RNA干扰技术迅速发展,为胶质瘤靶标研究提供了新思路.它不仅可以用于寻找与增殖、侵袭相关的靶标,更可以作为潜在的治疗手段,为胶质瘤靶向治疗提供强有力干预治疗。IKK/NF-K B通路是一个重要的癌细胞存活的信号通路。该通路中NF-KB的激活涉及IKB(NF—KB抑制剂)的磷酸化,而后者有赖于IKK (IKB激酶)的调控。IΚB激酶家族(kinases, IKKs)作为NF-KB信号途径的关键成员,能磷酸化IΚB上的特定位点,从而使IκBα泛素化并最终被蛋白酶体降解,解除IΚB对NF-KB的抑制.游离的NF-KB从胞质转移入细胞核,激活参与应激反应和免疫细胞活化、增殖、分化、凋亡及肿瘤形成等相关的400多种基因转录的调控。IKKε作为IKK家族新近发现的成员,在众多肿瘤中被确认高表达且在它们的恶性转化中起着重要作用。并且多数研究已经证实IKKε可以活化NF-KB通路是其致癌的重要机制。细胞实验及动物实验发现敲低IKKε对如乳腺癌,卵巢癌、前列腺癌等细胞有显著的抑癌作用,然而对IKKε在胶质瘤中的表达以及作用机制研究甚少。我们前期研究检测了9个胶质瘤细胞系(D32, D37, M067, H4, U138, U251, U87, U373, TP483)、3例正常脑组织和10例胶质瘤标本中IKKε表达,结果提示IKKε在大多数胶质瘤细胞系(仅TP483无IKKε表达)和胶质瘤标本中过表达,而同时在正常脑组织(3例)中几无表达。这些结果初步提示IKKε在胶质瘤的发生和发展中起着类似于乳腺癌中癌基因的作用。我们认为这些发现为进一步研究胶质瘤分子病理的致病机制提供了重要的线索,因此有必要对胶质瘤中IKKε/NF-K B通路在胶质瘤增殖和侵袭中的作用进行进一步研究。本课题第一部分应用RT-PCR的方法检测51例胶质瘤临床标本和7例正常脑组织以及7个细胞系IKKε的mRNA表达,应用免疫组化方法和蛋白印迹方法检测了IKKε基因在蛋白水平的表达。并研究IKKε表达与胶质瘤恶性程度之间的相关性。第二部分在体外应用RNA干涉技术以oligofectamine介导siRNA靶向IKKε转染人脑胶质母细胞瘤U251和LN229细胞后,应用realtime PCR和蛋白印迹检测目的基因和蛋白水平的敲低情况,采用细胞周期、MTT、细胞平板克隆实验检测敲低IKKs后的细胞增殖能力；采用划痕试验、侵袭试验检测细胞的迁移和侵袭能力,应用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。应用蛋白印迹和PCR分别检测了NF-KB通路中涉及增殖、侵袭、凋亡有关的蛋白,应用细胞免疫组化,细胞免疫荧光分别检测了敲低IKKε后NF-KB的细胞转座情况。分别提取细胞浆和细胞核内NF-KB组分P65应用蛋白印迹进一步验证转染IKKs siRNA后NF-KB的向细胞核转座情况。第三部分中则通过建立建立U251裸鼠皮下荷瘤模型,瘤内注射oligofectamine和siRNA的混合物,每2天测量一次肿瘤体积,动态观察肿瘤生长情况,检测RNA干涉技术敲低U251裸鼠胶质瘤IKKε的表达后NF-KB通路主要成员的表达变化,对体外实验的结果进一步验证。免疫组化法检测肿瘤标本的相关蛋白表达情况分析可能的抑癌机制。结果1.第一部分肿瘤标本显示40/51例IKKε有表达,Ⅲ/Ⅳ级中23/27例中／高表达。且和肿瘤级别呈正相关。同时还检测到4/7细胞系中IKKε过表达。胶质瘤IKKε表达强度随肿瘤恶性程度增加而增加。2.第二部分结果表明IKKε siRNA可有效敲低IKKε在胶质瘤细胞系U251和LN229细胞内的表达,细胞流式示细胞周期SPF下降,G0/G1阻滞,MTT法证实细胞增殖受抑制。且细胞的侵袭和迁移能力明显降低；敲低IKKε后细胞中IκBα水平升高,NF-KB向细胞核的转座明显减少。然而,本实验显示IKKε似乎和凋亡无显著相关。3.第三部分成功构建裸鼠皮下胶质瘤模型,IKKε siRNA组显示肿瘤生长速度减慢,体积变小。免组化结果表明靶向IKKε siRNA组较无义siRNA组NF-KB通路下游增殖侵袭指标的表达下调。结论1. IKKs在人脑胶质瘤中过表达,和肿瘤病理分级正相关,可能参与胶质瘤的进展。2. IKKs促进胶质瘤恶性进展是通过IκB/NF-K B通路实现的。3.体内外实验基本一致,证实人工合成IKKε siRNA可以有效的抑制胶质瘤的生物学行为。4. IKKε可成为基因治疗的侯选基因,RNA干涉是一项有效的基因沉默的新技术,有潜在临床应用前景。