论文部分内容阅读
肺癌是目前全球范围内发生率和死亡率最高的癌症,肺腺癌是发生率最高的肺癌亚型,占肺癌发生率的40%左右。与其他几种肺癌亚型相比,肺腺癌在年轻、非吸烟女性中的发生率较高,且EGFR基因在该类人群中易发生突变。EGFR是生长因子受体家族中的一员,可通过信号通路调控促进细胞的增殖、迁移、分化和血管新生,并且能够抑制细胞的凋亡,在肿瘤细胞的增殖和侵袭中发挥重要作用。在肺癌中,EGFR酪氨酸激酶区的突变主要发生在18～21外显子,其中19外显子的缺失（19-del）突变和21外显子上的点突变（L858R）更为重要,占EGFR基因突变的90%左右。这两种突变均对EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）敏感,拥有此突变的患者服用EGFR-TKI后不仅毒副作用小,而且无进展生存期（FPS）和总体生存期（OS）均明显优于常规化疗。但是目前并未完全阐明EGFR敏感突变与肺癌转移之间存在何种关系,以及EGFR敏感突变是通过何种机制影响肺癌细胞转移的。在该研究中,我们收集了 2015年1月至2016年4月在上海市肺科医院胸外科术后接受基因检测的肺腺癌患者,并分析了EGFR敏感突变与肺癌淋巴结转移的相关性。结果显示:EGFR-L858R突变与肺腺癌的转移负相关（388/762 vs 84/220,P<0.001）。我们还选择了 82对有纵膈淋巴结转移的肺腺癌患者,对其原发灶和转移灶进行EGFR基因测序,结果显示,在22例原发灶包含EGFR-L858R突变的患者中,仅10例在转移灶中检测到EGFR-L858R突变;在21例原发灶包含EGFR-19del突变的患者中,16例转移灶中检测到了 EGFR-19-del突变。随后的随访结果显示,生存期超过60个月的患者其转移灶均为EGFR-WT。这些结果说明EGFR-L858R突变与肺腺癌的转移呈现负相关。为了阐明EGFR-L858R是通过何种机制影响肺癌转移的,我们分别构建了EGFR-WT和EGFR-L858R过表达质粒,在转染肺腺癌细胞H1299和A549后,采用CCK8实验检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期和细胞死亡,伤口愈合实验检测细胞迁移,克隆形成实验检测克隆形成率,3D细胞侵袭实验检测细胞侵袭能力,同时采用荧光定量PCR检测干细胞相关目的基因的mRNA表达水平,采用Western Blot方法检测相关目的基因的蛋白表达水平。我们的研究结果显示,在正常细胞实验浓度下,EGFR-L858R突变不影响肺腺癌细胞H1299和A549的增殖和迁移能力;当细胞浓度较低时,EGFR-L858R突变能够降低肺腺癌细胞H1299的增殖和侵袭能力;EGFR-L858R突变也降低肺腺癌细胞H1299的克隆形成率。在EGFR-L858R突变的H1299细胞中,与细胞干性相关的基因C-kit、CD133、SOX2、4-Oct的转录和表达水平均明显低于转染EGFR-WT 的 H1299 细胞,C-kit、CD133、SOX2、4-Oct 在EGFR-L858R突变的肺腺癌患者组织中的表达水平也明显低于EGFR-WT的肺腺癌患者组织中的表达水平。除了药敏突变外,EGFR 20外显子上的点突变（T790M）和插入突变（20-ins）均对 EGFR-TKI 耐药,属于耐药突变。目前的研究尚未完全阐明EGFR-T790M耐药突变与肺腺癌患者影像学特征及临床预后的关系。在该研究中,我们对2013年1月至2017年12月在上海市肺科医院胸外科术后,接受基因检测的非小细胞肺癌患者的EGFR-T790M突变情况进行统计,并分析其与肺腺癌患者影像学特征及临床预后的相关性。结果显示:EGFR-T790M单突变在肺腺癌患者中的突变率低于在非腺肺癌患者中的突变率,且EGFR-T790M突变易与EGFR-L858R共存;EGFR-T790M突变的患者具有明显的影像学特征,即更容易出现明显的分叶（P=0.025）,肿瘤形状更不规则（P=0.047）,肿瘤边缘易出现毛刺（P=0.005）。通过对患者临床预后的分析我们发现,T790M突变阴性患者的无进展生存期长于T790M突变阳性患者,（OR=3.37,95%CI=1.67-6.79,P=0.001）;患者术后无论是否接受辅助治疗,T790M突变阳性患者的无进展生存期都明显低于T790M突变阴性患者;T790M突变阳性的患者出现不少于2处转移的概率明显高于T790M突变阴性的患者（P=0.039）。综合上述实验结果,我们推测:1.早期肺腺癌EGFR-L858R突变与转移负相关是由细胞干性降低引起的,我们的研究结果为EGFR-L858R突变在肺腺癌中的作用提供了新视野;2.EGFR-T790M突变的患者具有比较独特的影响学特征;与EGFR-T790M共突变能够缩短EGFR主要药敏突变患者的无进展生存期,并促进EGFR主要药敏突变患者的远处转移,因此,EGFR-T790M突变与肺腺癌患者预后不良相关。