【摘 要】
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研究背景 假肥大性进行性肌营养不良又称Duchenne型肌营养不良(Duchenne Muscular Dystrophy,DMD,OMIM 310200)是常见的X连锁隐性遗传病,发病率为1/3500活产男婴,女性多为致病基因的携带者.通常5岁左右发病,20岁左右死于呼吸衰竭等严重并发症,目前尚无特效治疗措施,预后差. 1987年,Hoffman等人利用免疫学方法确认了抗肌萎缩蛋白(Dystro
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研究背景 假肥大性进行性肌营养不良又称Duchenne型肌营养不良(Duchenne Muscular Dystrophy,DMD,OMIM 310200)是常见的X连锁隐性遗传病,发病率为1/3500活产男婴,女性多为致病基因的携带者.通常5岁左右发病,20岁左右死于呼吸衰竭等严重并发症,目前尚无特效治疗措施,预后差. 1987年,Hoffman等人利用免疫学方法确认了抗肌萎缩蛋白(Dystrophin)与杜氏肌营养不良的发病相关.编码抗肌萎缩蛋白的基因命名为DM),位于X染色体上,全长超过2.2Mb,包含79个外显子,cDNA长度约14kb.研究表明,DMD基因的致病突变类型主要包括缺失型(约50％-65％)、重复(约5％-10％)和微小突变(包括点突变、剪切突变和插入/缺失突变,约20％-35％).目前检测DMD基因的方法包括1)多重PCR：可检测24个外显子的缺失；2) 多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA),可以检测79个外显子的缺失或重复；3) Sanger测序,可以检测微小突变.临床上常用的是MLPA和Sanger测序,两者一般结合使用.目的 利用序列捕获结合第二代高通量测序技术,对215例临床确诊病人DMD基因79个外显子及邻近内含子区DNA序列进行突变筛查,为产前诊断提供依据,建立遗传病临床应用平台.方法1)根据DMD基因的外显子及邻近内含子基因组坐标(Hg19)设计捕获探针；2)收集DMD男性患者213例,女性患者2例,抽取外周血并提取基因组DNA,后者经超声波打断后,按照Illumina标准制备流程构建文库,后与探针进行杂交反应,洗去非特异结合片段,捕获的核酸用于高通量测序；3)利用BWA分析软件对测序数据进行比对分析,获取SNP(单碱基置换)、InDel(缺失/插入)及读序(read)比对数目等信息,经过一系列过滤流程及统计学分析,筛选出致病突变；4)使用Sanger测序及MLPA或定量PCR的方法对突变进行验证.结果 通过对这215例典型的DMD患者的数据分析,最终发现外显子完全缺失(断裂点在内含子区)52例(24.2％)；外显子部分缺失(断裂点在外显子区)3例(1.4％)；外显子重复突变17例(7.9％)；微小突变138例(64.2％)；未检出突变5例(2.3％).除去3例外显子部分缺失和5例未检出的病例,其他结果Sanger测序及MLPA、定量PCR结果完全一致.结论这种基于高通量测序的DMD基因检测技术是集合了基因拷贝数变异及微小突变于一身的检测平台,具有高效、准确、自动化的优点,可用于遗传病的临床诊断和产前突变筛查.
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