【摘 要】
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构建肝细胞生长因子(hapatocyte growth factor,HGF)真核表达载体,并观察其在人正常肝细胞中的表达以及促细胞增殖和抗损伤能力.利用基因重组技术将HGF与绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)融合并构建真核表达质粒,通过脂质体介导法,导入正常人肝细胞系中.用荧光显微镜以及免疫组化方法观察到HGF表达.采用[3H].TdR掺入DNA法、PC
【机 构】
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第四军医大学 西京医院肝胆外科,西安 710032 第四军医大学 秦都医院病理科
【出 处】
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中国科协第五届青年学术年会——陕西卫星会议
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构建肝细胞生长因子(hapatocyte growth factor,HGF)真核表达载体,并观察其在人正常肝细胞中的表达以及促细胞增殖和抗损伤能力.利用基因重组技术将HGF与绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)融合并构建真核表达质粒,通过脂质体介导法,导入正常人肝细胞系中.用荧光显微镜以及免疫组化方法观察到HGF表达.采用[3H].TdR掺入DNA法、PCNA免疫组化观察肝细胞DNA合成.用CC14造成急性肝细胞损伤.通过测定细胞存活率、细胞内丙氨酸氨基转移酶(ALT)、K+的漏出量了解肝细胞的抗损伤能力.酶切鉴定证实HGF片断已克隆到pEGFP-N3的BamHI和SaII位点之间,在转染人正常肝细胞后。利用荧光显微铣观察可见到绿色荧光蛋白的表达.
用免疫组化方法进一步证实了HGF蛋白在细胞中的表达.[3H]-TdR掺入DNA法观察肝细胞DNA合成结果显示.经转导huHGF的肝细胞的DNA合成明显增加(转染96h后,[3H]-TdR掺入量为对照组的7倍).PCNA免疫组化结果显示转导huHGF的肝细胞阳性率明显增加。也提示转导huHGF使肝细胞增殖活性增加.转导huHGF后可使肝细胞抗CCl4损伤的能力明显增强,表现在肝细胞存活率显著提高(83％vs61％.P<0.05).细胞内丙氨酸氨基转移酶(ALT)、K+的漏出显著降低(分别为35.16 U-L-1 vs 65.31U-L-1.P<0.01,5.59 mmol/L vs 6.02 mmol/L.P<0.01).另外从转导的肝细胞提取的培养液可对其它非转染细胞起促增殖作用。而这种作用可被HGF抗体封闭,提示HGF可被转导的肝细胞分泌到培养液中,井且分泌的HGF具有活性.本实验显示转染的HGF可表达并有促细胞分裂活性.而且转染HGF后的肝细胞抗肝损伤能力增强.为进一步了解HGF分子生物学特性厦治疗应用提供了理论基础.
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