蛋白质饲料原料的匮乏已经成为一个世界性的问题,在我国尤其严重。寻找和开发新型蛋白质原料成为近年来我国畜牧科研人员的研究课题。血粉是一种良好的动物源性蛋白原料,血粉的开发和利用不仅缓解了蛋白质原料匮乏的问题,还可以起到保护自然环境的作用。血液经离心分离后得到血浆蛋白和血球蛋白,其中血浆蛋白已经得到了很好的应用且效果显著,而血球蛋白部分由于存在氨基酸含量不平衡,有血腥味,动物机体内部的酶对血球粉的破膜效果差等缺点严重制约了血粉的利用。因此,如何利用血球粉就成为血粉利用过程中的最重要的关键。目前,利用微生物固态发酵血粉制备优质蛋白质饲料是国内研究的主要方向。而饲料和食品行业现有的优良发酵菌株主要是通过准性杂交、原生质体融合和突变等传统方法来提高真菌的性状,但这些方法存在操作目的性差、工作量大和效率低等缺点。随着现代分子生物学的发展,基因工程技术及蛋白质定向进化技术己成为菌株改良的有效途径。本试验目的是利用分子生物学技术,培育一种新的基因工程菌,从中筛选出产中性蛋白酶活性较高的菌株并用于发酵血粉,并通过响应面法确定发酵参数,优化发酵工艺。方法:将米曲霉中性蛋白酶基因导入毕赤酵母并表达。经过蛋白酶活力筛选,得到一株高产中性蛋白酶重组毕赤酵母菌株,并利用此筛选出的重组菌株对血球粉进行发酵。将血粉拌入麦麸中,接种重组菌株,经酶促反应,将血球粉降解为肽和氨基酸以提高其消化率。在液体发酵条件下,以水解度为检测指标,采用茚三酮显色法探讨初始pH、发酵温度、发酵时间、接种量、摇床转速等单因素对血球粉发酵的影响。并在这些单因素试验的基础上,利用SPSS20.0软件比较组间差异,确定3个主要影响因素,根据Box-Behnken中心组合试验设计原理,采用响应面分析法,以血粉发酵后的水解度为响应值作响应面,摸索血球粉发酵的最适条件。结果如下:(1)将克隆得到的米曲霉中性蛋白酶基因电转入毕赤酵母,成功获得了阳性重组酵母菌。(2)通过中性蛋白酶活力筛选,得到一株高产蛋白酶的重组毕赤酵母菌,并用于发酵血球粉。(3)在确定试验条件的最佳参数范围后,综合单因素试验,通过三因素三水平响应面法对试验条件进行优化,得出了在初始pH 8.1、培养温度33.9℃,发酵时间116.6 h条件下,试验结果最优。在该条件下模型对发酵血粉水解度的预测值为49.46%。为验证模型的准确性及有效性,在初始pH 8.1、摇床转速200 r/min、接种量2.0%、培养温度33.9℃条件下,发酵血粉116.6 h,重复6次试验,结果发现发酵血粉的水解度达到了49.05%,与预测结果基本相符,响应面模型有效。