背景:人类半月板纤维软骨细胞可能会对有积极生物学效应的生长因子产生反应,例如人胰岛素样生长因子Ⅰ,半月板细胞也可能会成为将来临床基因治疗的有效供体。目的:拟观察人半月板纤维软骨细胞对人胰岛素样生长因子Ⅰ的效应反应。设计、时间及地点:开放性实验,于2007-10/2008-04在青岛大学附属医院骨科实验室完成。材料:收集半月板撕裂和盘状半月板患者关节镜手术中切取的半月板组织用于人半月板纤维软骨细胞培养。方法:利用聚合酶链式反应从人肝细胞cDNA文库中获得人胰岛素样生长因子Ⅰ基因,将其克隆入双顺反子真核表达载体pIRES2-EGFP中。将关节镜手术中切取的成人半月板组织,体外进行分离培养。利用阳离子脂质体FuGene6将人胰岛素样生长因子Ⅰ转染入人半月板纤维软骨细胞中。主要观察指标:转染人胰岛素样生长因子Ⅰ后增强型绿色荧光蛋白的表达;检测细胞上清中人胰岛素样生长因子Ⅰ的分泌浓度;流式细胞仪检测细胞转染后的变化。结果:基因测序及酶切,聚合酶链反应等均证实人胰岛素样生长因子Ⅰ基因的正确克隆,并形成正确的真核表达载体pIRES2-EGFP-hIGF-Ⅰ。人半月板纤维软骨细胞在接种40h后贴壁并伸展为成纤维细胞样,三角形或多角形外观。增强型绿色荧光蛋白的表达逐渐增加,在转染后56h达到峰值。细胞上清中人胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白质的浓度变化趋势类似增强型绿色荧光蛋白的表达,峰值可达22.68μg/L。蛋白免疫印迹、反转录-聚合酶链反应和免疫组织化学染色均证实人胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白质的存在。转染后部分细胞表型发生变化,增殖加速。流式细胞仪检测转染后S期细胞比例增多。结论:人类半月板纤维软骨细胞可被阳离子脂质体安全有效地转染,转染的人胰岛素样生长因子Ⅰ基因可分泌较高水平的生长因子并加速细胞的增殖。