【摘 要】
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目的:构建钙离子通道蛋白TRPV5小激活RNA(SaRNA)慢病毒载体,建立稳定激活TRPV5表达的大鼠肾小管上皮细胞株(NRK细胞株)。方法:针对大鼠TRPV5基因的启动子区域,设计并合成5条
【机 构】
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广州医科大学附属第一医院微创中心泌尿外科广东省泌尿外科重点实验室
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目的:构建钙离子通道蛋白TRPV5小激活RNA(SaRNA)慢病毒载体,建立稳定激活TRPV5表达的大鼠肾小管上皮细胞株(NRK细胞株)。方法:针对大鼠TRPV5基因的启动子区域,设计并合成5条特异性SaRNA序列,通过脂质体转染和Western blot筛选出激活效应最强的SaRNA序列,连入慢病毒表达载体中构建重组质粒LV3-TRPV5-SaRNA,对重组质粒进行测序鉴定后进行慢病毒包装;利用生产的慢病毒颗粒感染NRK细胞,经嘌呤霉素筛选得到阳性克隆后进行扩增培养,通过RT-PCR和Western blot检测扩增后的阳性克隆细胞中TRPV5的mRNA和蛋白表达水平。结果:Western blot的检测结果显示SaRNA-320可以明显激活即上调TRPV5的表达水平;测序结果显示目的序列SaRNA-320正确插入LV3表达载体中;SaRNA-320慢病毒颗粒稳定感染的NRK细胞中TRPV5的mRNA和蛋白表达水平均明显升高。结论:成功构建了大鼠TRPV5基因的SaRNA慢病毒重组载体并获得TRPV5稳定过表达的NRK细胞株,为进一步利用小激活RNA技术以及研究钙离子通道在含钙结石的病因及防治中的作用及机制提供了扎实的实验基础。
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