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摘要：以3个基因型大豆无菌实生苗的真叶和胚轴为外植体，在MS培养基上附加不同浓度的TDZ、NAA、6-BA以及2，4-D，研究不同激素浓度对大豆愈伤组织诱导及继代培养的影响，结果表明：在愈伤组织诱导阶段，以真叶为外植体时，吉农28+1.5 mg/L TDZ+0.2 mg/L NAA+200 mg/L 活性炭为最佳组合；以胚轴为外植体，吉农17+1.0 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA+200 mg/L 活性炭为最佳组合。在继代组织培养阶段，对真叶诱导形成的愈伤组织而言，吉农17+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+3.0 mg/L2，4-D为最佳组合；对胚轴诱导的愈伤组织而言，吉农17+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L2，4-D为最佳组合。
关键词：大豆；愈伤组织；激素；继代培养
中图分类号： S565.104 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）04-0040-02
收稿日期：2013-08-19
基金项目：吉林省科技发展计划（编号：201101111）；吉林省教育厅科学技术研究项目（编号：2011-41）；吉林省科技厅项目（编号：20120215）；吉林省科技成果转化补助项目（编号：20095044）；吉林农业大学科研启动基金（编号：201242）。
作者简介：刘思言（1979—），女，吉林四平人，硕士，讲师，主要从事作物生物技术研究。E-mail：siyan_2001@163.com。
通信作者：王丕武，教授，博士生导师。E-mail：peiwuw@yahoo.com.cn。大豆是全世界重要的粮食和经济作物，也是人类主要的食用蛋白和工业原料来源，与人们的日常生活息息相关[1-2]。大豆的组织培养技术起步较晚，直到20世纪80年代的中后期大豆组织培养技术才取得了突破性的进展，大豆的原生质体培养、子叶节培养和胚尖培养相继取得了成功[3-13]。但大豆愈伤组织诱导的研究相对较少，而愈伤组织诱导具有外植体来源广泛，扩繁量大等优点[14]。尤其是随着近些年来大豆遗传转化的研究越来越多，能通过愈伤组织诱导建立一个高效的遗传转化受体系统更具有重要的意义。本试验以TDZ、NAA、6-BA、2，4-D为供试激素作为生长调节剂，以吉农28、吉农27、吉农17 3种基因型为材料，进行大豆愈伤组织的诱导和继代培养，以期找到最适合诱导和继代培养大豆愈伤组织的培养基，为建立一个高效的大豆愈伤组织遗传转化受体系统奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
吉农28、 吉农27、 吉农17的种子均由吉林农业大学生物技术中心提供。
1.2试验方法
1.2.1种子的萌发挑取成熟饱满的大豆种子，先用75%的乙醇消毒30 s，再用0.1%的升汞溶液消毒10 min，无菌水冲洗3～5次，接种到MS基础培养基上，培养7 d后取胚轴，14 d后取真叶作为外植体材料。
1.2.2愈伤组织的诱导以无菌实生苗的胚轴、真叶为外植体，分别接种于添加不同浓度激素的MS愈伤组织诱导培养基中，采用四因素三水平的L9（34）正交设计（表1），将各处理放置于黑暗条件下培养7 d，然后置于恒温的黑暗12 h，光照12 h的培养箱中，于20 d后统计其愈伤组织诱导情况。
伤组织的诱导多以一定浓度的2，4-D和6-BA配合使用，朱学艺等[15]在培养基中添加6-BA后，愈伤组织出愈率低，形成的愈伤组织结构紧密，呈小颗粒状；NAA和6-BA结合使用诱导出的大豆愈伤组织也呈现质地坚硬的特点，愈伤组织量也相对较少[16]。TDZ是一种苯基脲衍生物，具有类细胞分裂素活性，已被广泛用于大豆组织培养，在孙明杰[24]等的研究中使用低浓度TDZ和6-BA配比，通过愈伤组织途径获得再生植株，提高了植株再生效率。本研究以3种不同基因型大豆的真叶及胚轴为外植体，不同的激素配比进行大豆愈伤组织诱导和继代研究，结果表明，在愈伤组织诱导阶段：以真叶为外植体时，最佳的组合为吉农28+1.5 mg/L TDZ+0.2 mg/L NAA+200 mg/L 活性炭；当以胚轴作为外植体时，诱导愈伤组织最佳组合为吉农17+1.0 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA+200 mg/L 活性炭。在愈伤组织继代培养阶段：以真叶作为外植体时，最佳的组合为吉农17+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+3.0 mg/L 2，4-D；以胚轴为外植体时，最佳的组合为吉农17+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L 2，4-D。
参考文献：
[1]Wang H J，Murphy P A. Isoflavone content in commercial soybean foods[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，1994，42：1666-1673.
[2]杨超. 大豆植株再生和遗传转化技术体系的研究[D]. 南京：南京农业大学，2009.
[3]Cheng T Y，Saka H，Voqui-Dinh T H. Plant regeneration from soybean cotyledonary node segments in culture[J]. Plant Science Letters，1980，19：91-99.
[4]肖文言，王连铮. 大豆幼荚子叶原生质体培养及植株再生[J]. 作物学报，1994，20（6）：665-669，769.
[5]王升吉，吴元华，王洪岩，等. 大豆不同外植体组织培养及再生研究[J]. 沈阳农业大学学报，1999，30（3）：255-259.
[6]Yoshida T. Adventitious shoot formation from hypocotyls sections of mature soybean seeds[J]. Breeding Science，2002，52：1-8.
[7]邱承祥，武天龙. 6-BA对大豆茎尖诱导再生植株的研究[J]. 大豆科学，2003，22（1）：32-35.
[8]Wang P，Wang G，Jing J I，et al. A novel systerm for proliferation，maintenance and plantlet germination from somatic embryo of soybean[J]. Acta Botanica Sinica，2004，46（2）：154-158.
[9]林树柱，曹越平，卫志明，等. 6-BA诱导大豆子叶节和茎尖出芽的研究[J]. 上海交通大学学报：农业科学版，2005，23（2）：138-142.
[10]李海燕，武小霞，刘淼，等. 大豆子叶节、胚尖再生植株的研究[J]. 大豆科学，2007，26（5）：709-712.
[11]孙文丽，刘昱辉，吴元华，等. 大豆胚尖再生体系的建立及转基因初步研究[J]. 湖北农业科学，2008，47（6）：615-618.
[12]张东旭，张洁，商蕾，等. 大豆胚尖再生体系的研究[J]. 河北农业大学学报，2008，31（4）：7-13.
[13]武小霞，李静，姜成涛，等. 大豆子叶节再生中植物生长调节剂浓度及基因型筛选[J]. 中国油料作物学报，2011，33（2）：123-129.
[14]谢从华，柳俊. 植物细胞工程[M]. 北京：高等教育出版社，2004：236.
[15]朱学艺，梁晓芳，李红芳. 激素对大豆悬浮细胞系愈伤组织诱导的影响[J]. 厦门大学学报：自然科学版，2008，47（4）：562-566.
[16]李大玮，Schmid J，Keller E R. 植物生长调节剂的使用和大豆愈伤组织的诱导及保持[J]. 遗传，1989，11（2）：1-4，49.
关键词：大豆；愈伤组织；激素；继代培养
中图分类号： S565.104 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）04-0040-02
收稿日期：2013-08-19
基金项目：吉林省科技发展计划（编号：201101111）；吉林省教育厅科学技术研究项目（编号：2011-41）；吉林省科技厅项目（编号：20120215）；吉林省科技成果转化补助项目（编号：20095044）；吉林农业大学科研启动基金（编号：201242）。
作者简介：刘思言（1979—），女，吉林四平人，硕士，讲师，主要从事作物生物技术研究。E-mail：siyan_2001@163.com。
通信作者：王丕武，教授，博士生导师。E-mail：peiwuw@yahoo.com.cn。大豆是全世界重要的粮食和经济作物，也是人类主要的食用蛋白和工业原料来源，与人们的日常生活息息相关[1-2]。大豆的组织培养技术起步较晚，直到20世纪80年代的中后期大豆组织培养技术才取得了突破性的进展，大豆的原生质体培养、子叶节培养和胚尖培养相继取得了成功[3-13]。但大豆愈伤组织诱导的研究相对较少，而愈伤组织诱导具有外植体来源广泛，扩繁量大等优点[14]。尤其是随着近些年来大豆遗传转化的研究越来越多，能通过愈伤组织诱导建立一个高效的遗传转化受体系统更具有重要的意义。本试验以TDZ、NAA、6-BA、2，4-D为供试激素作为生长调节剂，以吉农28、吉农27、吉农17 3种基因型为材料，进行大豆愈伤组织的诱导和继代培养，以期找到最适合诱导和继代培养大豆愈伤组织的培养基，为建立一个高效的大豆愈伤组织遗传转化受体系统奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
吉农28、 吉农27、 吉农17的种子均由吉林农业大学生物技术中心提供。
1.2试验方法
1.2.1种子的萌发挑取成熟饱满的大豆种子，先用75%的乙醇消毒30 s，再用0.1%的升汞溶液消毒10 min，无菌水冲洗3～5次，接种到MS基础培养基上，培养7 d后取胚轴，14 d后取真叶作为外植体材料。
1.2.2愈伤组织的诱导以无菌实生苗的胚轴、真叶为外植体，分别接种于添加不同浓度激素的MS愈伤组织诱导培养基中，采用四因素三水平的L9（34）正交设计（表1），将各处理放置于黑暗条件下培养7 d，然后置于恒温的黑暗12 h，光照12 h的培养箱中，于20 d后统计其愈伤组织诱导情况。
伤组织的诱导多以一定浓度的2，4-D和6-BA配合使用，朱学艺等[15]在培养基中添加6-BA后，愈伤组织出愈率低，形成的愈伤组织结构紧密，呈小颗粒状；NAA和6-BA结合使用诱导出的大豆愈伤组织也呈现质地坚硬的特点，愈伤组织量也相对较少[16]。TDZ是一种苯基脲衍生物，具有类细胞分裂素活性，已被广泛用于大豆组织培养，在孙明杰[24]等的研究中使用低浓度TDZ和6-BA配比，通过愈伤组织途径获得再生植株，提高了植株再生效率。本研究以3种不同基因型大豆的真叶及胚轴为外植体，不同的激素配比进行大豆愈伤组织诱导和继代研究，结果表明，在愈伤组织诱导阶段：以真叶为外植体时，最佳的组合为吉农28+1.5 mg/L TDZ+0.2 mg/L NAA+200 mg/L 活性炭；当以胚轴作为外植体时，诱导愈伤组织最佳组合为吉农17+1.0 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA+200 mg/L 活性炭。在愈伤组织继代培养阶段：以真叶作为外植体时，最佳的组合为吉农17+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+3.0 mg/L 2，4-D；以胚轴为外植体时，最佳的组合为吉农17+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L 2，4-D。
参考文献：
[1]Wang H J，Murphy P A. Isoflavone content in commercial soybean foods[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，1994，42：1666-1673.
[2]杨超. 大豆植株再生和遗传转化技术体系的研究[D]. 南京：南京农业大学，2009.
[3]Cheng T Y，Saka H，Voqui-Dinh T H. Plant regeneration from soybean cotyledonary node segments in culture[J]. Plant Science Letters，1980，19：91-99.
[4]肖文言，王连铮. 大豆幼荚子叶原生质体培养及植株再生[J]. 作物学报，1994，20（6）：665-669，769.
[5]王升吉，吴元华，王洪岩，等. 大豆不同外植体组织培养及再生研究[J]. 沈阳农业大学学报，1999，30（3）：255-259.
[6]Yoshida T. Adventitious shoot formation from hypocotyls sections of mature soybean seeds[J]. Breeding Science，2002，52：1-8.
[7]邱承祥，武天龙. 6-BA对大豆茎尖诱导再生植株的研究[J]. 大豆科学，2003，22（1）：32-35.
[8]Wang P，Wang G，Jing J I，et al. A novel systerm for proliferation，maintenance and plantlet germination from somatic embryo of soybean[J]. Acta Botanica Sinica，2004，46（2）：154-158.
[9]林树柱，曹越平，卫志明，等. 6-BA诱导大豆子叶节和茎尖出芽的研究[J]. 上海交通大学学报：农业科学版，2005，23（2）：138-142.
[10]李海燕，武小霞，刘淼，等. 大豆子叶节、胚尖再生植株的研究[J]. 大豆科学，2007，26（5）：709-712.
[11]孙文丽，刘昱辉，吴元华，等. 大豆胚尖再生体系的建立及转基因初步研究[J]. 湖北农业科学，2008，47（6）：615-618.
[12]张东旭，张洁，商蕾，等. 大豆胚尖再生体系的研究[J]. 河北农业大学学报，2008，31（4）：7-13.
[13]武小霞，李静，姜成涛，等. 大豆子叶节再生中植物生长调节剂浓度及基因型筛选[J]. 中国油料作物学报，2011，33（2）：123-129.
[14]谢从华，柳俊. 植物细胞工程[M]. 北京：高等教育出版社，2004：236.
[15]朱学艺，梁晓芳，李红芳. 激素对大豆悬浮细胞系愈伤组织诱导的影响[J]. 厦门大学学报：自然科学版，2008，47（4）：562-566.
[16]李大玮，Schmid J，Keller E R. 植物生长调节剂的使用和大豆愈伤组织的诱导及保持[J]. 遗传，1989，11（2）：1-4，49.