枣疯病植原体TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

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  摘要:根据枣疯病植原体16S rDNA基因保守区域设计、合成特异性引物和TaqMan探针,以构建的重组质粒作为阳性标准品,建立并优化了对枣疯病植原体的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。对优化后的方法进行灵敏度、特异性及稳定性评价,制作了标准曲线。结果显示,制作的标准曲线有极好的线性关系,相关系数(r2)达到0.998,建立的实时荧光定量PCR检测方法能够特异性地检测枣疯病植原体,能检测到60拷贝的质粒DNA。本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法灵敏度、特异性、重复性好,不仅能够实现对枣疯病植原体的快速检测,而且为实现从病原定量水平上对枣疯病病情分级奠定了基础。 全文查看链接   对反应体系中的引物、探针浓度分别进行优化。将引物对浓度从0.1~1.0 μmol/L以0.1 μmol/L依次递增,探针浓度从0.05~0.5 μmol/L以0.05 μmol/L依次递增,其他条件均不变,通过ΔRn与循环数关系的曲线图确定ΔRn值最大且Ct值最小的最佳引物浓度和探针浓度。 全文查看链接   廖晓兰等[13]首次将实时荧光PCR技术用于植原体的检测,设计并合成了植原体广谱荧光探针和针对椰子致死黄化组(16SrⅣ组)、苹果丛生组(16SrⅩ 组)和榆树黄化组(16SrⅤ组)植原体的组特异性荧光探针,成功地检测了9种植原体。侯立华等[14]设计合成了榆树黄化组(16SrⅤ组)探针对枣疯病植原体拷贝数进行了定量检测,灵敏度达到了85 拷贝/μL。已报道这些方法是针对植原体16SrⅤ组设计的引物和探针,用于检测植原体16SrⅤ组的成员,实现植原体组间的特异性检测。16SrⅤ组划分为3个亚组[15],包括榆树黄化(16SrⅤA)枣疯病(16SrⅤB)、葡萄金黄化(16SrⅤC)等多种重要的植原体。研究发现,16SrⅤ组内的植原体菌株间序列差异很小(全文查看链接   [13]廖晓兰, 朱水芳, 陈红运, 等. 植原体TaqMan探针实时荧光PCR检测鉴定方法的建立[J]. 植物病理学报, 2002,32(4):361367. 全文查看链接
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