【摘 要】
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目的 使用重叠PCR方法构建构建△A146Ply突变体,原核可溶性表达△A146Ply蛋白,并明确其毒力变化情况;分析肺炎链球菌溶血素(pneumolysin,Ply)在不同血清型肺炎链球菌(strepto
【机 构】
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重庆医科大学医学临床检验诊断学教育部重点实验室,重庆市,400016上海市浦东新区宣桥社区卫生服务中心防保科,上海市,201314;
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目的 使用重叠PCR方法构建构建△A146Ply突变体,原核可溶性表达△A146Ply蛋白,并明确其毒力变化情况;分析肺炎链球菌溶血素(pneumolysin,Ply)在不同血清型肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae,SPN)中的表达情况.方法 以SPN D39型基因组DNA为模板设计合成构建突变体ply基因所需引物;利用重叠PCR方法扩增合成△A146ply突变体.通过溶血实验分析其溶血活性,利用中和试验验证△A146Ply诱导产生的特异性抗体中和野生Ply毒素溶血能力,并利用Western印迹检测5株不同血清型肺炎链球菌流行菌株中Ply蛋白表达情况.结果 突变体基因测序结果显示,Ply146位密码子GCT 3个碱基被缺失,△A146ply突变体构建成功,并实现了△A146Ply的可溶性表达,得到纯度＞90 %的重组蛋白.△A146Ply蛋白浓度为100 000 ng/ml亦未表现出溶血活性.△A146Ply蛋白诱导产生的特异性抗体能够中和野生Ply毒素的溶血活性.Western印迹结果显示,△A146Ply诱导产生的多克隆抗体可与国内临床常见4株肺炎链球菌有交叉反应.结论 △A146Ply蛋白是一种安全的肺炎链球菌疫苗候选分子,可刺激机体产生具有中和作用的特异性抗体.
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