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摘 要：运用超高效液相-串联质谱法（UPLC-MS/MS）同时测定辣椒面、火锅料、辣条、鸭蛋、鸭血中的苏丹红Ⅰ～Ⅳ。通过优化萃取试剂、样品基质效应的消除、色谱及质谱条件等参数，检测方法的灵敏度和适用性。在电喷雾离子源正离子模式下，多反应监测（MRM）方式检测，外标法定量。苏丹红Ⅰ～Ⅳ线性关系良好，相关系数（r2）均大于0.999，苏丹红Ⅰ～Ⅳ在3个添加水平下，回收率范围为85.1%～104.9%，标准偏差（RSD）均小于6.2%，检出限和定量限为1.0～6.0?g/kg。本方法处理过程简单、分析时间短、准确度高，适用于辣椒面、火锅料、辣条、鸭蛋和鸭血中的苏丹红Ⅰ～Ⅳ检测，可用于食品中非法添加苏丹红Ⅰ～Ⅳ的筛查。
关键词：超高效液相-串联质谱法;苏丹红;非法添加
苏丹红共有4个组分，为苏丹红Ⅰ～Ⅳ，是一种红色颗粒或粉末状的红色染料常用于工业上色如鞋、地板等的增光，因为有致癌作用危害人体健康，我国和欧盟都禁止其用于食品生产[1]。市面上有一些不法分子为了产品成色漂亮好出售，依然违法添加工业染料。
目前，苏丹红Ⅰ～Ⅳ检测方法主要有薄层色谱法[2]、紫外可见分光光度法[3]、近红外显微成像光谱法[4]、液相色谱法[5-6]、液相色谱-质谱联用法[7-8]和化学发光分析法[9]，这些方法前处理复杂、试剂用量大、检测周期长、准确度不高，不适应实际工作中遇到的多种复杂基质中苏丹红的筛查测定。本试验通过对色谱条件和质谱参数的研究、优化，建立了高效液相色谱-串联质谱同时分析苏丹红Ⅰ～Ⅳ的方法。本方法前处理简单，7 min即可同时测出苏丹红Ⅰ～Ⅳ的含量，方法快速简单，结果准确，可以用于食品中非法添加苏丹红Ⅰ～Ⅳ的筛查。
1 材料与方法
1.1 仪器与试药
液相色谱-串联质谱联用仪：Qtrap 5500三重四极杆串联质谱仪（美国AB SCIEX公司）;配有电喷雾离子源（ESI）;LC20A超高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司）;MS1003S电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）;Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）;MFV-24智能氮吹仪（广州德泰仪器科技有限公司）。
1.2 药品及试剂
实验用苏丹红Ⅰ～Ⅳ标准品，纯度均大于95%，购自Dr.Ehrenstorfer GmbH;甲醇、乙腈（色谱纯，美国Mreda公司）;甲酸（色谱纯，美国Fisher Scientific公司）;水为超纯水。
样品辣椒面、火锅料、辣条、鸭蛋、鸭血均为市售。
1.3 标准溶液的配制
分别各精密量取适量标准溶液，加乙腈制成每1 mL中各约含1.0 mg的溶液，为标准储备液密封，于4 ℃保存。分别量取上述苏丹红Ⅰ～Ⅳ标准储备液适量，用甲醇稀释成约0.5 mg/mL的混合对照品储备液。精密量取混合对照品储备液适量，加空白样品基质提取液配制系列混合基质标准溶液。
1.4 样品处理方法
提取。取待测试样适量混匀，研细，称取粉末5.0 g（准确至0.001 g），置50 mLpvc离心管中，加15 mL乙腈超声提取（功率300 W，频率50 kHz）30 min，以6000 r/min离心5 min，取上清有机液，残渣加15 mL乙腈复提一次，合并两次有机液于鸡心瓶，旋转蒸发近干，备用。
净化。将上述提取的样品用1 mL的乙腈溶解，混匀，转移到氧化铝层析柱上，用正己烷洗脱，氮吹浓缩置近干，1 mL乙腈复溶，过0.22 μm滤膜，备用。
1.5 色谱条件和质谱条件
色谱柱：Waters UPLC BEH柱（3.0 ?m，2.1mm×100 mm）;柱温：35 ℃;进样量：5 μL;流动相：A相为0.1%甲酸水溶液，B相为乙腈溶液，进行梯度洗脱，流速：0.6 mL/min。
电离源模式：电喷雾离子化;电离源极性：正离子模式;雾化气：氮气;掃描方式：正离子扫描;检测方式：多反应监测（MRM）;电喷雾电压：4000 V;离子源温度：150 ℃、碰撞电压（CE）为20～30 V、去簇电压（DP）30～40 V。具体待测物的准确质量数及碎片离子为：苏丹红Ⅰ249.1/156.1，249.1/232.2;苏丹红Ⅱ277.3/156.1，277.3/160.1;苏丹红Ⅲ253.2/156.1，253.2/197.0;苏丹红Ⅳ381.1/224.3，381.1/275.8。
2 结果和分析
2.1 质谱方法的建立
将苏丹红Ⅰ～Ⅳ标准品储备液分别稀释成浓度约为200 ?g/L，按照上述色谱和质谱条件进样检测，在7 min内苏丹红Ⅰ～Ⅳ能得到很好分离，方法条件满足辣椒面、火锅料、辣条、鸭蛋、鸭血中的苏丹红Ⅰ～Ⅳ的测定。
2.2 标准曲线和检出限
在上述本实验色谱和质谱条件下，取1.3混合系列标准溶液0～500 μg/L，绘制标准曲线，以定量离子峰面积y对质量浓度x（μg/L）做线性回归，得到苏丹红Ⅰ～Ⅳ的线性方程和相关系数。苏丹红Ⅰ：y=1 271.7x+3 854.8，苏丹红Ⅱ：y=1 540.1x+4 678.5，苏丹红Ⅲ：y=1 383.2x+2 432.3，苏丹红Ⅳ：y=1 262.1x+2 743.3，r2均大于等于0.999。将混合系列溶液的最低浓度点溶液稀释后进样分析，测定信噪比，取信噪比约为3的溶液浓度作为定性检测限，信噪比约为10的溶液浓度作为定量检测限。检出限和定量限为1.0～6.0 ?g/kg。
2.3 精密度和重复性试验
按本实验条件，在5种不同基质样品中进行3个添加水平（0.1 ?g/mL、0.2 ?g/mL、0.5 ?g/mL）的加标回收实验，每个添加水平平行实验6次。苏丹红Ⅰ的平均回收率为89.3%、93.5%、91.9%;苏丹红Ⅱ的平均回收率为92.2%、91.4%、104.9%;苏丹红Ⅲ的平均回收率为87.9%、88.0%、90.5%;苏丹红Ⅳ的平均回收率为85.1%、86.9%、91.5%，平均相对标准偏差分别为4.05%、3.2%、6.18%，表明该方法具有良好的精密度和准确度。可满足食品中苏丹红Ⅰ～Ⅳ的分析要求。
2.4 样品测定
应用建立的本方法，对市场销售的50批次辣椒面、火锅料、辣条、鸭蛋、鸭血样品进行了筛查，所测样品中均未检出苏丹红Ⅰ～Ⅳ。
3 结论
本研究建立的UPLC-MS/MS高分辨率质谱检测方法，可同时测定食品中非法添加苏丹红Ⅰ～Ⅳ，样品没有复杂的处理过程，操作简便，可在7 min内完成整个分析，提高了检验效率。采用液相色谱-串联质谱的MRM模式进行定性和定量检测，灵敏度、准确度高，适用于食品中非法添加苏丹红Ⅰ～Ⅳ的检测。
参考文献
[1]牛家华，卢明华，王勇.食品中7种常见的非食用色素检测研究进展[J].化学通报，2020，83（9）：805-812.
[2]佟蕊，齐颖，扈晓鹏，等.薄层色谱与表面增强拉曼光谱联用快速检测辣椒油高脂肪基质中的苏丹红[J].中国食品学报，2019，19（6）：223-229.
[3]李锦城.紫外可见分光光度法检测蛋黄中微量苏丹红Ⅳ[J].食品安全导刊，2019（3）：60-61.
[4]石冬冬，康雪，李庆波，等.近红外显微成像光谱法快速定性鉴别蛋鸭饲料中的苏丹红[J].饲料研究，2017 （21）：36-41.
[5]孙雪娜.高效液相色谱法测定食品中苏丹红的研究[J].中国食品，2021（9）：68.
[6]闻威，张文芬，张岩皓，等.多孔芳香骨架吸附剂-固相萃取-高效液相色谱法同时测定辣椒粉中4种偶氮类染料[J].色谱，2019，37（5）：491-498.
[7]彭飞进，杨云华，李艳梅，等.凝胶色谱-HPLC及LC/MS/MS法测定食品中苏丹红染料[J].中国调味品，2020，45（12）：145-148.
[8]范赛，张楠，刘平，等.超高效液相色谱-串联质谱法检测熟肉制品中10种工业染料残留[J].食品安全质量检测学报，2020，11（13）：4177-4184.
[9]虞叶道，赵舒景.食品中苏丹红的电化学测定研究[J].广东化工，2018，45（18）：74-75.
关键词：超高效液相-串联质谱法;苏丹红;非法添加
苏丹红共有4个组分，为苏丹红Ⅰ～Ⅳ，是一种红色颗粒或粉末状的红色染料常用于工业上色如鞋、地板等的增光，因为有致癌作用危害人体健康，我国和欧盟都禁止其用于食品生产[1]。市面上有一些不法分子为了产品成色漂亮好出售，依然违法添加工业染料。
目前，苏丹红Ⅰ～Ⅳ检测方法主要有薄层色谱法[2]、紫外可见分光光度法[3]、近红外显微成像光谱法[4]、液相色谱法[5-6]、液相色谱-质谱联用法[7-8]和化学发光分析法[9]，这些方法前处理复杂、试剂用量大、检测周期长、准确度不高，不适应实际工作中遇到的多种复杂基质中苏丹红的筛查测定。本试验通过对色谱条件和质谱参数的研究、优化，建立了高效液相色谱-串联质谱同时分析苏丹红Ⅰ～Ⅳ的方法。本方法前处理简单，7 min即可同时测出苏丹红Ⅰ～Ⅳ的含量，方法快速简单，结果准确，可以用于食品中非法添加苏丹红Ⅰ～Ⅳ的筛查。
1 材料与方法
1.1 仪器与试药
液相色谱-串联质谱联用仪：Qtrap 5500三重四极杆串联质谱仪（美国AB SCIEX公司）;配有电喷雾离子源（ESI）;LC20A超高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司）;MS1003S电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）;Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）;MFV-24智能氮吹仪（广州德泰仪器科技有限公司）。
1.2 药品及试剂
实验用苏丹红Ⅰ～Ⅳ标准品，纯度均大于95%，购自Dr.Ehrenstorfer GmbH;甲醇、乙腈（色谱纯，美国Mreda公司）;甲酸（色谱纯，美国Fisher Scientific公司）;水为超纯水。
样品辣椒面、火锅料、辣条、鸭蛋、鸭血均为市售。
1.3 标准溶液的配制
分别各精密量取适量标准溶液，加乙腈制成每1 mL中各约含1.0 mg的溶液，为标准储备液密封，于4 ℃保存。分别量取上述苏丹红Ⅰ～Ⅳ标准储备液适量，用甲醇稀释成约0.5 mg/mL的混合对照品储备液。精密量取混合对照品储备液适量，加空白样品基质提取液配制系列混合基质标准溶液。
1.4 样品处理方法
提取。取待测试样适量混匀，研细，称取粉末5.0 g（准确至0.001 g），置50 mLpvc离心管中，加15 mL乙腈超声提取（功率300 W，频率50 kHz）30 min，以6000 r/min离心5 min，取上清有机液，残渣加15 mL乙腈复提一次，合并两次有机液于鸡心瓶，旋转蒸发近干，备用。
净化。将上述提取的样品用1 mL的乙腈溶解，混匀，转移到氧化铝层析柱上，用正己烷洗脱，氮吹浓缩置近干，1 mL乙腈复溶，过0.22 μm滤膜，备用。
1.5 色谱条件和质谱条件
色谱柱：Waters UPLC BEH柱（3.0 ?m，2.1mm×100 mm）;柱温：35 ℃;进样量：5 μL;流动相：A相为0.1%甲酸水溶液，B相为乙腈溶液，进行梯度洗脱，流速：0.6 mL/min。
电离源模式：电喷雾离子化;电离源极性：正离子模式;雾化气：氮气;掃描方式：正离子扫描;检测方式：多反应监测（MRM）;电喷雾电压：4000 V;离子源温度：150 ℃、碰撞电压（CE）为20～30 V、去簇电压（DP）30～40 V。具体待测物的准确质量数及碎片离子为：苏丹红Ⅰ249.1/156.1，249.1/232.2;苏丹红Ⅱ277.3/156.1，277.3/160.1;苏丹红Ⅲ253.2/156.1，253.2/197.0;苏丹红Ⅳ381.1/224.3，381.1/275.8。
2 结果和分析
2.1 质谱方法的建立
将苏丹红Ⅰ～Ⅳ标准品储备液分别稀释成浓度约为200 ?g/L，按照上述色谱和质谱条件进样检测，在7 min内苏丹红Ⅰ～Ⅳ能得到很好分离，方法条件满足辣椒面、火锅料、辣条、鸭蛋、鸭血中的苏丹红Ⅰ～Ⅳ的测定。
2.2 标准曲线和检出限
在上述本实验色谱和质谱条件下，取1.3混合系列标准溶液0～500 μg/L，绘制标准曲线，以定量离子峰面积y对质量浓度x（μg/L）做线性回归，得到苏丹红Ⅰ～Ⅳ的线性方程和相关系数。苏丹红Ⅰ：y=1 271.7x+3 854.8，苏丹红Ⅱ：y=1 540.1x+4 678.5，苏丹红Ⅲ：y=1 383.2x+2 432.3，苏丹红Ⅳ：y=1 262.1x+2 743.3，r2均大于等于0.999。将混合系列溶液的最低浓度点溶液稀释后进样分析，测定信噪比，取信噪比约为3的溶液浓度作为定性检测限，信噪比约为10的溶液浓度作为定量检测限。检出限和定量限为1.0～6.0 ?g/kg。
2.3 精密度和重复性试验
按本实验条件，在5种不同基质样品中进行3个添加水平（0.1 ?g/mL、0.2 ?g/mL、0.5 ?g/mL）的加标回收实验，每个添加水平平行实验6次。苏丹红Ⅰ的平均回收率为89.3%、93.5%、91.9%;苏丹红Ⅱ的平均回收率为92.2%、91.4%、104.9%;苏丹红Ⅲ的平均回收率为87.9%、88.0%、90.5%;苏丹红Ⅳ的平均回收率为85.1%、86.9%、91.5%，平均相对标准偏差分别为4.05%、3.2%、6.18%，表明该方法具有良好的精密度和准确度。可满足食品中苏丹红Ⅰ～Ⅳ的分析要求。
2.4 样品测定
应用建立的本方法，对市场销售的50批次辣椒面、火锅料、辣条、鸭蛋、鸭血样品进行了筛查，所测样品中均未检出苏丹红Ⅰ～Ⅳ。
3 结论
本研究建立的UPLC-MS/MS高分辨率质谱检测方法，可同时测定食品中非法添加苏丹红Ⅰ～Ⅳ，样品没有复杂的处理过程，操作简便，可在7 min内完成整个分析，提高了检验效率。采用液相色谱-串联质谱的MRM模式进行定性和定量检测，灵敏度、准确度高，适用于食品中非法添加苏丹红Ⅰ～Ⅳ的检测。
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