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摘要 目的：运用网络药理学和分子对接的方法探讨“杜仲-牛膝”药对治疗骨质疏松的分子机制。方法：通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）筛选杜仲、牛膝含有的活性成分及作用靶点;利用GeneCards、DisGeNET和CTD数据库收集骨质疏松（OP）相关靶点基因;采用Cytoscape 3.8.0软件和STRING数据库进行“药物-活性成分-靶点”网络和蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建与分析;FunRich3.1.3软件DAVID数据库进行基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG） 富集分析（P<0.05）;运用Maestro version 11.5对主要活性成分及靶点蛋白进行分子对接。结果：获得“杜仲-牛膝”药对治疗OP的活性成分共42个和133个有效靶点;获得251条GO生物过程和90条相关信号通路，涉及PI3K-AKT、TNF、Wnt、HIF-1、MAPK信号通路等。结论：“杜仲-牛膝”药对可能通过调控细胞增殖、分化与凋亡、骨代谢来治疗OP，具有多成分、多靶点、多系统的特点，为系统阐明“杜仲-牛膝”药对主要成分治疗OP的分子机制提供了参考。
关键词 杜仲;牛膝;网络药理学;分子对接;骨质疏松;分子机制
Abstract Objective：To explore the molecular mechanism of Cortex Eucommiae-Achyranthes bidentata in the treatment of osteoporosis by network pharmacology and molecular docking.Methods：TCMSP database was used to screen the active components and action targets of Cortex Eucommiae-Achyranthes bidentata.We used GeneCards，DisGeNET and CTD database to collect osteoporosis（Osteoporosis，OP） related target genes; used Cytoscape 3.8.0 software and STRING database to construct and analyze the “drug-active ingredient-target” network and PPI network; FunRich3.1.3 Software DAVID database were used forGO analysis and KEGG enrichment analysis（P<0.05）; we used Maestro version 11.5 to perform molecular docking of the main active ingredients and target proteins.Results：We obtained a total of 42 active ingredients and 133 effective targets of “Cortex Eucommiae-Achyranthes bidentata” drug for the treatment of OP; and obtained 251 GO biological processes and 90 related signal pathways，involving PI3K-AKT，TNF，Wnt，HIF-1，MAPK signal pathway etc.Conclusion：Cortex Eucommiae-Achyranthes bidentata drug pair may treat OP by regulating cell proliferation，differentiation and apoptosis，and bone metabolism.It has the characteristics of multi-component，multi-target and multi-system，which provides a reference for systematically elucidating the molecular mechanism of Cortex Eucommiae-Achyranthes bidentata drug pair in treating OP.
Keywords Cortex Eucommiae; Achyranthes bidentata; Network pharmacology; Molecular docking; Osteoporosis; Molecular mechanism
中圖分类号：R285.6文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.20.002
骨质疏松症（Osteoporosis，OP）是最常见的骨骼疾病，是以全身性骨量减少，骨的微观结构退化为特征，表现为单位体积的骨量降低，矿盐和骨基质比例减少，生物脆性上升，导致骨的力学强度衰减，骨折风险上升的一种全身性骨代谢疾病[1]。2001年美国国立卫生研究院（USA National Institutes of Health，NIH）将其定义为以骨折风险概率增加和骨的生物力学强度下降为特征的骨骼疾病，并提示骨量降低是骨质疏松性骨折的主要危险因素，但还存在其他危险因素。我国OP的总患病率为6.6%～19.3%，平均为13%，其中约20%的患者会发生骨质疏松性骨折[2]。许多临床研究结果表明，临床上常用的抗OP的西药均具有一定的不良反应，如长期使用激素治疗的患者，其患骨坏死、冠心病、乳腺癌等疾病的概率将有不同程度的升高[3]。骨质疏松的临床症状与中医疾病“骨痿”中的“不通则痛”“腰脊不举”“两足软弱”“不任其身”等表现相符。中医以“骨痿”论治骨质疏松，重温补肾阳、强筋壮骨，兼以通经活络、祛风除湿、补气养血[4]。 杜仲味辛、平，性甘、温，无毒，具有补肝肾，强筋骨，安胎等功效，《本草会言》曰：“腰膝之痛，非杜仲不除……补肝益肾，诚为要药。”牛膝味苦、酸，性甘平，主逐瘀通经，补肝肾，强筋骨，《医学衷参西录》认为：“牛膝为补益之品而善引气血下注，故善治肾虚腰痛，或腿痿不能任地。”OP的主要病机在“肾虚”，肾为先天之本，人体的生长壮老皆由肾气的盛衰所主导[5]。而杜仲、牛膝补益肝肾、壮腰膝、强筋骨的功效显著，其药性温和、不易产生不良反应，是治疗OP的优选中药[6]。此两药最早配伍使用可追溯到《寿亲养老新书》中“不老丸”一方。“杜仲-牛膝”药对是治疗OP的常用组方药对，但两药配对应用后其多靶点作用机制尚不明确。
网络药理学是生物信息领域高速发展的一门新兴学科，它集成了虚拟计算，高通量的基因组分析和网络数据库搜寻等方法，其基于系统生物学和药物多靶标多通路理论构建“药材-成分-靶标”网络，分析通路机制，为药物新方向预测和疾病的多向治疗提供了导向[7]。分子对接是经由受体的特性以及受体和药物小分子之间的互相效用形式来施行药物设计的门径。主要探讨分子间（如配体和受体）的相互作用，并预测其连接式样和亲和力的一种理论仿效方法[8]。本研究使用网络药理学及分子对接技术，探讨“杜仲-牛膝”药对中有效成分与靶标蛋白之间的互作关系，研究其药对配伍后治疗OP的可能作用机制，为后续的研究验证提供理论参考。
1 资料与方法
1.1 药材中所含活性成分的筛选 在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）以“杜仲”“牛膝”为关键词，搜索杜仲、牛膝中含有的已知化学成分[9]。以药物动力学原理为基础，口服生物利用度（OB）是经口服用的药物中所含有的有效成分或活性物质被人体吸收到达体循环的速度与程度，类药性（DL）则是用以评价药物分子成药性高低的指标[10]。结合文献研究，将OB≥30%，DL≥0.18作为筛选标准，筛選出杜仲、牛膝中的活性成分[11]。
1.2 药物靶点的筛选及“药物-活性成分-靶点”网络的构建 将1.1项下筛选出的活性成分导入TCMSP数据库中进行检索，查找出药物靶标蛋白，通过Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）进行靶标蛋白以及基因信息的校正。将药物活性成分、靶点蛋白导入Cytoscape 3.8.0软件，构建“药物-活性成分-靶点”网络并进行显著性分析，筛选出关键活性成分。
1.3 “杜仲-牛膝”治疗OP的潜在作用靶点获取 在GeneCards（https：//www.genecards.org/）、DisGeNET（http：//www.disgenet.org/）以及Comparative Toxicogenomics Database数据库（http：//ctdbase.org/）中以“Osteoporosis”或“OP”为关键词，设定物种为“Homo Sapiens”检索与OP相关的疾病靶点，通过韦恩图将“1.2”中筛选出的药物靶点与相关疾病靶点映射筛选出共同靶点，从而确定“杜仲-牛膝”药对治疗OP的潜在作用靶点。
1.4 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析 将1.3项中筛选得到的治疗OP潜在作用靶点导入STRING Version：11.0数据库[12]（https：//string-db.org/），Organism（种属）设为“Homo Sapiens（人类）”，得到PPI关系，保存数据为TSV格式。运用Cytoscape3.8.0软件构建PPI网络并分析筛选出核心靶点。
1.5 靶点富集分析与可视化 将“杜仲-牛膝”药对治疗OP的潜在作用靶点输入到FunRich3.1.3软件进行基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析，设定阈值为P<0.05，分别选取生物学过程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）、细胞组分（Cellular Component，CC）中显著性前6的条目通过“Analysis”功能构建图形可视化。使用DAVID 6.8数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）进行京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析[13]，设置P<0.05，通路分析选取与OP关联的且显著性较高的信号通路借助Omicshare（http：//omicshare.com/）进行可视化。
1.6 分子对接 将1.2项下筛选出的主要活性成分输入到ZINC（http：//zinc.docking.org/）数据库下载其3D结构，保存为“mol2”格式文件。将1.4项下筛选的核心蛋白靶点通过RCSB PDB数据库（http：//www.rcsb.org/）下载靶点蛋白的3D结构，保存为“pdb”格式文件，将靶点蛋白及活性成分的3D结构导入到MAESTRO version 11.5中，靶点蛋白通过“Protein preparation”套件去水、加氢生成pH值为7.0±2的小分子构象，活性成分通过“Ligprep”进行预处理，“Receptor Grid Gener”套件确定活性位点，运用“Ligand Docking”面板进行分子对接，对接方式为半柔性对接，以对接评分“Docking Score”评价“杜仲-牛膝”药对主要活性成分与靶点蛋白的结合情况。
2 结果
2.1 药物中主要化学成分的筛选 检索得到“杜仲-牛膝”药对中共290个化合物（5个为共有化合物），其中杜仲119个，牛膝176个。筛选出42个活性化合物，其中25个来自杜仲，20个来自牛膝，3个为共有化合物。见图1。“杜仲-牛膝”药对中部分活性化合物基本信息见表1。
2.2 “药物-活性成分-靶点”网络的构建与分析 该网络共有177个节点，其中包含2个药物节点、42个活性成分节点和133个靶点节点，共有885条边。其中蓝色菱形代表杜仲、牛膝，黄色三角形代表活性成分，红色箭头代表靶点，每条边表示节点之间的相互作用关系。见图2。借助“Network Analyze”功能对网络进行拓扑属性分析。筛选度值（Degree）较大的节点进行分析，这些节点在网络中起到了枢纽作用，可能是关键化合物或靶点。该网络中活性成分的平均度值为21.07。从活性成分方面分析，有51%的活性成分作用靶点≥21个，其中槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、汉黄芩素、刺桐灵碱、豆甾醇分别能与20个以上的靶点蛋白发生作用，这些可能是“杜仲-牛膝”药对中治疗OP的主要物质基础。 2.3 “杜仲-牛膝”药对治疗OP的潜在作用靶点 基于GeneCards收集到26个OP靶点，DisGeNET收集到63个，CTD收集到820个，三者合并去重后筛选共得到847个OP相关靶点，将“杜仲-牛膝”药对调控靶点和OP疾病靶点经过Venny在线平台（http：//www.interactivenn.net/）分析后，获得74个交集靶点，即为药物治疗OP的潜在作用靶点。见图3。
2.4 PPI网络拓扑分析 图4显示该网络共有74个节点、856条边，平均节点度值为23.14，图中节点的大小、颜色和度值是正相关关系，节点的度值越大，显示的节点越大且颜色越深。度值越大说明与其他蛋白相互作用更强一些，可能在发挥生物学功能中起着重要的作用。度值排名前10的靶点为白细胞介素6（IL6）、肿瘤坏死蛋白P53（TP53）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、肿瘤坏死因子（TNF）、JUN蛋白（JUN）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、表皮生长因子（EGF）、过氧化氢合成酶2（PTGS2）、表皮生长因子受体（EGFR）、丝裂原活化蛋白激酶8（MAPK8），这些靶点可能是“杜仲-牛膝”药对发挥治疗OP功效的关键靶点。
2.5 靶点富集分析 通过FunRich3.1.3软件共筛选得到GO条目343个（P<0.05），其中BP条目251个，MF条目64个，CC条目28个。其中BP主要涉及序列特异性DNA结合转录因子活性的正调控、细胞增殖的负调控、凋亡过程的负调控、细胞增殖、凋亡过程、血管生成等;MF主要涉及蛋白质结合、酶结合、蛋白质均二聚活性、ATP结合、锌离子结合等方面;CC方面主要涉及核、细胞质、细胞外空间、胞质溶胶、质膜等方面。各类别前6的条目见图5。
通过DAVID数据库筛选得到90条（P<0.05）KEGG富集信号通路。主要涉及癌症信号通路、钙信号通路、PI3K-AKT、TNF、Wnt、cAMP、HIF-1等信号通路。富集显著性前30的信号通路见图6。纵軸代表通路名称，横轴代表富集因素的百分比;气泡的大小和颜色分别代表富集靶点数和P值，颜色越红P值越小。杜仲-牛膝”药对和“PI3K-AKT信号通路的交集靶点见图7。
2.6 分子对接 选取PPI网络中度值排名前3的靶点蛋白，分别为IL6、TP53、VEGFA，与“药物-活性成分-靶点”网络中度值排名前3的活性成分，分别为槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚，利用Maestro Version 11.5软件进行分子对接。见表2。Docking Score的绝对值越大，化合物与靶点结合力越强，分子构象越稳定。根据对接分数大小评判，绝对值>4.25代表结合活性一般，绝对值>5.0代表结合活性比较好，绝对值>7.0代表结合活性较强[14]。分子对接结果显示IL6与槲皮素、山柰酚的亲和力最强，山柰酚与VEGFA的结合能力最强。图8可以观察到药物活性成分与靶点蛋白相结合的具体位点，黄色连线为二者之间的氢键相互作用力，为促使分子结合到活性位点的主要作用力。
3 讨论
随着人口老龄化进程的加速，OP的发病率紧随心血管病、糖尿病，已跃居至慢性疾病的第3位，成为世界的常见病和多发病[15]。现代医学对OP的治疗主要为雌激素替代疗法，但雌激素的长期使用会增加乳腺癌、冠心病等疾病的患病概率，其他临床上使用的化学合成药物均存在一定的不良反应[16]。而中药治疗OP具有不良反应小、疗效明确、经济负担小的特点。中医学认为OP归属于“骨痿”“骨枯”“骨痹”等范畴。肾主骨生髓，肾精充盈，则骨髓生化有源，肾气亏虚，则骨髓失养。由此，肾精亏损是该病的主要病机。而肝主筋，约束骨骼;脾主百骸，荣养四肢关节;因此骨质疏松的发病机制以肾虚为本，与肝虚、脾虚、血瘀密切相关[17]。杜仲、牛膝均可补肝肾，强筋骨。用于肝肾不足，腰膝酸痛，筋骨无力。现代研究发现，杜仲的化学成分主要有黄酮类、苯丙素类化合物以及多种氨基酸和微量元素，具有抗疲劳、抗骨质疏松等多种药理作用[18]。
根据网络药理学分析结果可以看出，槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇、黄芩素、刺桐灵碱、小檗碱是“杜仲-牛膝”药对中主要的活性成分。基于分子对接模拟其结合活性，结果显示槲皮素、山柰酚与IL6、TP53、VEGFA对接均具有较好的结合活性。槲皮素和山柰酚均为黄酮类化合物。郑红等[19]研究表明，槲皮素能够有效促进成骨分化，并通过上调BMP2和Smad4的表达改善OP。小鼠模型经槲皮素处理后测定骨质，发现其骨钙素含量上升，骨源性碱性磷酸酶（NBAP）及雌二醇的含量减少[20]。山柰酚能够增加骨密度，改善骨微结构，实验研究表明Ca2+代谢可被高剂量的山柰酚所影响，通过调节代谢平衡来促进构造蛋白质生成，改善骨小梁丢失以达到治疗骨质疏松的目的[21]。付方胜等[22]认为黄芩素可以抑制破骨细胞的形成以及抑制破骨细胞的骨吸收功能，从而预防OP的发生。并且在一定程度上减缓骨流失并部分恢复骨量，同时在体外可以促进骨髓间充质干细胞（BMMSCs）的增殖和成骨分化[23]。小檗碱可以促进p-AKT蛋白的表达，并通过激活PI3K/AKT信号通路来促进前成骨细胞的分化与矿化[24]。
本研究通过对“杜仲-牛膝”药对治疗OP的PPI网络分析，发现IL6、TP53、VEGFA、TNF、JUN、MAPK1、EGF、PTGS2、EGFR、MAPK8等靶点是“杜仲-牛膝”药对治疗OP的主要作用靶点。其中IL6在成骨偶联过程中发挥多重作用，成骨细胞与单核细胞均可合成IL6，IL6被合成后又直接作用于破骨细胞和成骨细胞，影响破骨细胞的活性，加速了OP的发生与发展[25]。VEGFA通过激活MAPK通路可以诱导BMSCs向成骨细胞分化，促进了成骨。TNF属于炎症介质，它可以刺激破骨细胞分化形成，促进分解代谢和骨细胞的破坏，是导致OP的重要环节[26]。TP53基因是一种肿瘤相关转录因子，在细胞应激活动中起重要作用。它通过激活多种细胞保护途径，诱导细胞凋亡，调节细胞周期，参与成骨破骨过程[27]。EGF称为表皮生长因子，Vary等[28]研究发现，成骨分化中的标志基因血清碱性磷酸酶和Ocn的表达可被EGF抑制，说明EGF可能影响成骨分化的负调控。JUN属于JUN蛋白家族中的一种，而JUN蛋白是转录因子激活蛋白-1（Activatorprotein1，AP-1）家族中4个亚家族中的1个，研究发现AP-1可通过调节相关基因表达，来影响细胞的凋亡过程，促进细胞凋亡，加快破骨前体细胞向破骨细胞分化[29-30]。MAPK1、MAPK8均属于丝裂原活化蛋白激酶家族，其可通过对成骨细胞增殖和分化过程的促进，进而诱导血管内皮细胞的形成来发挥对OP的防治作用[31]。EGFR是ERK2的上游信号分子，具有酪氨酸激酶活性，可以通过与表皮生长因子组合，启动细胞核内基因，从而促进细胞分裂[32]。 KEGG通路富集分析得到与OP较为相关的通路有PI3K-AKT、TNF、Wnt、HIF-1、MAPK信号通路。研究表明，PI3K-AKT信号通路参与骨质疏松、骨性关节炎、骨坏死等病理性骨病，并参与调控破骨细胞和成骨细胞的增殖、分化及凋亡[33]。正常生理情况下，PI3K-AKT信号通路可以选择性的影响成骨细胞和破骨细胞的生理功能，保护骨小梁结构，降低破骨细胞分化，通过降低Caspases-9活性，从而减轻细胞损伤所致的细胞凋亡，影响破骨细胞形成[34]。肿瘤坏死因子（TNF）信号通路具有调节破骨细胞活性及骨吸收的作用，其中分离出的糖蛋白骨保护素（Osteoprotegerin，OPG）对骨也具有积极的保护作用[35-36]。Wnt信号通路可以通过抑制MSCs向软骨和成脂谱系的分化，来增强成骨细胞谱系分化[37-38]。成骨细胞和骨细胞的Wnt信号通过OPG的分泌从而间接抑制破骨细胞的分化和骨吸收[39]。Wnt信号通路直接或间接地对成骨细胞和破骨细胞进行调控，在控制骨量与OP的发生发展方面具有重要作用。
综上所述，本研究通过网络药理学和分子对接相结合的方法，筛选出“杜仲-牛膝”药对治疗OP的活性成分，关键靶点和信号通路，发现“杜仲-牛膝”药对可能通过调控细胞增殖、分化与凋亡、骨代谢来治疗OP，具有多成分、多靶点、多系统的特点，并基于分子对接初步模拟其可能的分子作用机制，为“杜仲-牛膝”药对治疗OP机制研究提供了理论依据和线索。鉴于网络药理学及分子对接技术的局限性，其预测结果还需要进一步的研究验证。
参考文献
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关键词 杜仲;牛膝;网络药理学;分子对接;骨质疏松;分子机制
Abstract Objective：To explore the molecular mechanism of Cortex Eucommiae-Achyranthes bidentata in the treatment of osteoporosis by network pharmacology and molecular docking.Methods：TCMSP database was used to screen the active components and action targets of Cortex Eucommiae-Achyranthes bidentata.We used GeneCards，DisGeNET and CTD database to collect osteoporosis（Osteoporosis，OP） related target genes; used Cytoscape 3.8.0 software and STRING database to construct and analyze the “drug-active ingredient-target” network and PPI network; FunRich3.1.3 Software DAVID database were used forGO analysis and KEGG enrichment analysis（P<0.05）; we used Maestro version 11.5 to perform molecular docking of the main active ingredients and target proteins.Results：We obtained a total of 42 active ingredients and 133 effective targets of “Cortex Eucommiae-Achyranthes bidentata” drug for the treatment of OP; and obtained 251 GO biological processes and 90 related signal pathways，involving PI3K-AKT，TNF，Wnt，HIF-1，MAPK signal pathway etc.Conclusion：Cortex Eucommiae-Achyranthes bidentata drug pair may treat OP by regulating cell proliferation，differentiation and apoptosis，and bone metabolism.It has the characteristics of multi-component，multi-target and multi-system，which provides a reference for systematically elucidating the molecular mechanism of Cortex Eucommiae-Achyranthes bidentata drug pair in treating OP.
Keywords Cortex Eucommiae; Achyranthes bidentata; Network pharmacology; Molecular docking; Osteoporosis; Molecular mechanism
中圖分类号：R285.6文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.20.002
骨质疏松症（Osteoporosis，OP）是最常见的骨骼疾病，是以全身性骨量减少，骨的微观结构退化为特征，表现为单位体积的骨量降低，矿盐和骨基质比例减少，生物脆性上升，导致骨的力学强度衰减，骨折风险上升的一种全身性骨代谢疾病[1]。2001年美国国立卫生研究院（USA National Institutes of Health，NIH）将其定义为以骨折风险概率增加和骨的生物力学强度下降为特征的骨骼疾病，并提示骨量降低是骨质疏松性骨折的主要危险因素，但还存在其他危险因素。我国OP的总患病率为6.6%～19.3%，平均为13%，其中约20%的患者会发生骨质疏松性骨折[2]。许多临床研究结果表明，临床上常用的抗OP的西药均具有一定的不良反应，如长期使用激素治疗的患者，其患骨坏死、冠心病、乳腺癌等疾病的概率将有不同程度的升高[3]。骨质疏松的临床症状与中医疾病“骨痿”中的“不通则痛”“腰脊不举”“两足软弱”“不任其身”等表现相符。中医以“骨痿”论治骨质疏松，重温补肾阳、强筋壮骨，兼以通经活络、祛风除湿、补气养血[4]。 杜仲味辛、平，性甘、温，无毒，具有补肝肾，强筋骨，安胎等功效，《本草会言》曰：“腰膝之痛，非杜仲不除……补肝益肾，诚为要药。”牛膝味苦、酸，性甘平，主逐瘀通经，补肝肾，强筋骨，《医学衷参西录》认为：“牛膝为补益之品而善引气血下注，故善治肾虚腰痛，或腿痿不能任地。”OP的主要病机在“肾虚”，肾为先天之本，人体的生长壮老皆由肾气的盛衰所主导[5]。而杜仲、牛膝补益肝肾、壮腰膝、强筋骨的功效显著，其药性温和、不易产生不良反应，是治疗OP的优选中药[6]。此两药最早配伍使用可追溯到《寿亲养老新书》中“不老丸”一方。“杜仲-牛膝”药对是治疗OP的常用组方药对，但两药配对应用后其多靶点作用机制尚不明确。
网络药理学是生物信息领域高速发展的一门新兴学科，它集成了虚拟计算，高通量的基因组分析和网络数据库搜寻等方法，其基于系统生物学和药物多靶标多通路理论构建“药材-成分-靶标”网络，分析通路机制，为药物新方向预测和疾病的多向治疗提供了导向[7]。分子对接是经由受体的特性以及受体和药物小分子之间的互相效用形式来施行药物设计的门径。主要探讨分子间（如配体和受体）的相互作用，并预测其连接式样和亲和力的一种理论仿效方法[8]。本研究使用网络药理学及分子对接技术，探讨“杜仲-牛膝”药对中有效成分与靶标蛋白之间的互作关系，研究其药对配伍后治疗OP的可能作用机制，为后续的研究验证提供理论参考。
1 资料与方法
1.1 药材中所含活性成分的筛选 在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）以“杜仲”“牛膝”为关键词，搜索杜仲、牛膝中含有的已知化学成分[9]。以药物动力学原理为基础，口服生物利用度（OB）是经口服用的药物中所含有的有效成分或活性物质被人体吸收到达体循环的速度与程度，类药性（DL）则是用以评价药物分子成药性高低的指标[10]。结合文献研究，将OB≥30%，DL≥0.18作为筛选标准，筛選出杜仲、牛膝中的活性成分[11]。
1.2 药物靶点的筛选及“药物-活性成分-靶点”网络的构建 将1.1项下筛选出的活性成分导入TCMSP数据库中进行检索，查找出药物靶标蛋白，通过Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）进行靶标蛋白以及基因信息的校正。将药物活性成分、靶点蛋白导入Cytoscape 3.8.0软件，构建“药物-活性成分-靶点”网络并进行显著性分析，筛选出关键活性成分。
1.3 “杜仲-牛膝”治疗OP的潜在作用靶点获取 在GeneCards（https：//www.genecards.org/）、DisGeNET（http：//www.disgenet.org/）以及Comparative Toxicogenomics Database数据库（http：//ctdbase.org/）中以“Osteoporosis”或“OP”为关键词，设定物种为“Homo Sapiens”检索与OP相关的疾病靶点，通过韦恩图将“1.2”中筛选出的药物靶点与相关疾病靶点映射筛选出共同靶点，从而确定“杜仲-牛膝”药对治疗OP的潜在作用靶点。
1.4 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析 将1.3项中筛选得到的治疗OP潜在作用靶点导入STRING Version：11.0数据库[12]（https：//string-db.org/），Organism（种属）设为“Homo Sapiens（人类）”，得到PPI关系，保存数据为TSV格式。运用Cytoscape3.8.0软件构建PPI网络并分析筛选出核心靶点。
1.5 靶点富集分析与可视化 将“杜仲-牛膝”药对治疗OP的潜在作用靶点输入到FunRich3.1.3软件进行基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析，设定阈值为P<0.05，分别选取生物学过程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）、细胞组分（Cellular Component，CC）中显著性前6的条目通过“Analysis”功能构建图形可视化。使用DAVID 6.8数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）进行京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析[13]，设置P<0.05，通路分析选取与OP关联的且显著性较高的信号通路借助Omicshare（http：//omicshare.com/）进行可视化。
1.6 分子对接 将1.2项下筛选出的主要活性成分输入到ZINC（http：//zinc.docking.org/）数据库下载其3D结构，保存为“mol2”格式文件。将1.4项下筛选的核心蛋白靶点通过RCSB PDB数据库（http：//www.rcsb.org/）下载靶点蛋白的3D结构，保存为“pdb”格式文件，将靶点蛋白及活性成分的3D结构导入到MAESTRO version 11.5中，靶点蛋白通过“Protein preparation”套件去水、加氢生成pH值为7.0±2的小分子构象，活性成分通过“Ligprep”进行预处理，“Receptor Grid Gener”套件确定活性位点，运用“Ligand Docking”面板进行分子对接，对接方式为半柔性对接，以对接评分“Docking Score”评价“杜仲-牛膝”药对主要活性成分与靶点蛋白的结合情况。
2 结果
2.1 药物中主要化学成分的筛选 检索得到“杜仲-牛膝”药对中共290个化合物（5个为共有化合物），其中杜仲119个，牛膝176个。筛选出42个活性化合物，其中25个来自杜仲，20个来自牛膝，3个为共有化合物。见图1。“杜仲-牛膝”药对中部分活性化合物基本信息见表1。
2.2 “药物-活性成分-靶点”网络的构建与分析 该网络共有177个节点，其中包含2个药物节点、42个活性成分节点和133个靶点节点，共有885条边。其中蓝色菱形代表杜仲、牛膝，黄色三角形代表活性成分，红色箭头代表靶点，每条边表示节点之间的相互作用关系。见图2。借助“Network Analyze”功能对网络进行拓扑属性分析。筛选度值（Degree）较大的节点进行分析，这些节点在网络中起到了枢纽作用，可能是关键化合物或靶点。该网络中活性成分的平均度值为21.07。从活性成分方面分析，有51%的活性成分作用靶点≥21个，其中槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、汉黄芩素、刺桐灵碱、豆甾醇分别能与20个以上的靶点蛋白发生作用，这些可能是“杜仲-牛膝”药对中治疗OP的主要物质基础。 2.3 “杜仲-牛膝”药对治疗OP的潜在作用靶点 基于GeneCards收集到26个OP靶点，DisGeNET收集到63个，CTD收集到820个，三者合并去重后筛选共得到847个OP相关靶点，将“杜仲-牛膝”药对调控靶点和OP疾病靶点经过Venny在线平台（http：//www.interactivenn.net/）分析后，获得74个交集靶点，即为药物治疗OP的潜在作用靶点。见图3。
2.4 PPI网络拓扑分析 图4显示该网络共有74个节点、856条边，平均节点度值为23.14，图中节点的大小、颜色和度值是正相关关系，节点的度值越大，显示的节点越大且颜色越深。度值越大说明与其他蛋白相互作用更强一些，可能在发挥生物学功能中起着重要的作用。度值排名前10的靶点为白细胞介素6（IL6）、肿瘤坏死蛋白P53（TP53）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、肿瘤坏死因子（TNF）、JUN蛋白（JUN）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、表皮生长因子（EGF）、过氧化氢合成酶2（PTGS2）、表皮生长因子受体（EGFR）、丝裂原活化蛋白激酶8（MAPK8），这些靶点可能是“杜仲-牛膝”药对发挥治疗OP功效的关键靶点。
2.5 靶点富集分析 通过FunRich3.1.3软件共筛选得到GO条目343个（P<0.05），其中BP条目251个，MF条目64个，CC条目28个。其中BP主要涉及序列特异性DNA结合转录因子活性的正调控、细胞增殖的负调控、凋亡过程的负调控、细胞增殖、凋亡过程、血管生成等;MF主要涉及蛋白质结合、酶结合、蛋白质均二聚活性、ATP结合、锌离子结合等方面;CC方面主要涉及核、细胞质、细胞外空间、胞质溶胶、质膜等方面。各类别前6的条目见图5。
通过DAVID数据库筛选得到90条（P<0.05）KEGG富集信号通路。主要涉及癌症信号通路、钙信号通路、PI3K-AKT、TNF、Wnt、cAMP、HIF-1等信号通路。富集显著性前30的信号通路见图6。纵軸代表通路名称，横轴代表富集因素的百分比;气泡的大小和颜色分别代表富集靶点数和P值，颜色越红P值越小。杜仲-牛膝”药对和“PI3K-AKT信号通路的交集靶点见图7。
2.6 分子对接 选取PPI网络中度值排名前3的靶点蛋白，分别为IL6、TP53、VEGFA，与“药物-活性成分-靶点”网络中度值排名前3的活性成分，分别为槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚，利用Maestro Version 11.5软件进行分子对接。见表2。Docking Score的绝对值越大，化合物与靶点结合力越强，分子构象越稳定。根据对接分数大小评判，绝对值>4.25代表结合活性一般，绝对值>5.0代表结合活性比较好，绝对值>7.0代表结合活性较强[14]。分子对接结果显示IL6与槲皮素、山柰酚的亲和力最强，山柰酚与VEGFA的结合能力最强。图8可以观察到药物活性成分与靶点蛋白相结合的具体位点，黄色连线为二者之间的氢键相互作用力，为促使分子结合到活性位点的主要作用力。
3 讨论
随着人口老龄化进程的加速，OP的发病率紧随心血管病、糖尿病，已跃居至慢性疾病的第3位，成为世界的常见病和多发病[15]。现代医学对OP的治疗主要为雌激素替代疗法，但雌激素的长期使用会增加乳腺癌、冠心病等疾病的患病概率，其他临床上使用的化学合成药物均存在一定的不良反应[16]。而中药治疗OP具有不良反应小、疗效明确、经济负担小的特点。中医学认为OP归属于“骨痿”“骨枯”“骨痹”等范畴。肾主骨生髓，肾精充盈，则骨髓生化有源，肾气亏虚，则骨髓失养。由此，肾精亏损是该病的主要病机。而肝主筋，约束骨骼;脾主百骸，荣养四肢关节;因此骨质疏松的发病机制以肾虚为本，与肝虚、脾虚、血瘀密切相关[17]。杜仲、牛膝均可补肝肾，强筋骨。用于肝肾不足，腰膝酸痛，筋骨无力。现代研究发现，杜仲的化学成分主要有黄酮类、苯丙素类化合物以及多种氨基酸和微量元素，具有抗疲劳、抗骨质疏松等多种药理作用[18]。
根据网络药理学分析结果可以看出，槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇、黄芩素、刺桐灵碱、小檗碱是“杜仲-牛膝”药对中主要的活性成分。基于分子对接模拟其结合活性，结果显示槲皮素、山柰酚与IL6、TP53、VEGFA对接均具有较好的结合活性。槲皮素和山柰酚均为黄酮类化合物。郑红等[19]研究表明，槲皮素能够有效促进成骨分化，并通过上调BMP2和Smad4的表达改善OP。小鼠模型经槲皮素处理后测定骨质，发现其骨钙素含量上升，骨源性碱性磷酸酶（NBAP）及雌二醇的含量减少[20]。山柰酚能够增加骨密度，改善骨微结构，实验研究表明Ca2+代谢可被高剂量的山柰酚所影响，通过调节代谢平衡来促进构造蛋白质生成，改善骨小梁丢失以达到治疗骨质疏松的目的[21]。付方胜等[22]认为黄芩素可以抑制破骨细胞的形成以及抑制破骨细胞的骨吸收功能，从而预防OP的发生。并且在一定程度上减缓骨流失并部分恢复骨量，同时在体外可以促进骨髓间充质干细胞（BMMSCs）的增殖和成骨分化[23]。小檗碱可以促进p-AKT蛋白的表达，并通过激活PI3K/AKT信号通路来促进前成骨细胞的分化与矿化[24]。
本研究通过对“杜仲-牛膝”药对治疗OP的PPI网络分析，发现IL6、TP53、VEGFA、TNF、JUN、MAPK1、EGF、PTGS2、EGFR、MAPK8等靶点是“杜仲-牛膝”药对治疗OP的主要作用靶点。其中IL6在成骨偶联过程中发挥多重作用，成骨细胞与单核细胞均可合成IL6，IL6被合成后又直接作用于破骨细胞和成骨细胞，影响破骨细胞的活性，加速了OP的发生与发展[25]。VEGFA通过激活MAPK通路可以诱导BMSCs向成骨细胞分化，促进了成骨。TNF属于炎症介质，它可以刺激破骨细胞分化形成，促进分解代谢和骨细胞的破坏，是导致OP的重要环节[26]。TP53基因是一种肿瘤相关转录因子，在细胞应激活动中起重要作用。它通过激活多种细胞保护途径，诱导细胞凋亡，调节细胞周期，参与成骨破骨过程[27]。EGF称为表皮生长因子，Vary等[28]研究发现，成骨分化中的标志基因血清碱性磷酸酶和Ocn的表达可被EGF抑制，说明EGF可能影响成骨分化的负调控。JUN属于JUN蛋白家族中的一种，而JUN蛋白是转录因子激活蛋白-1（Activatorprotein1，AP-1）家族中4个亚家族中的1个，研究发现AP-1可通过调节相关基因表达，来影响细胞的凋亡过程，促进细胞凋亡，加快破骨前体细胞向破骨细胞分化[29-30]。MAPK1、MAPK8均属于丝裂原活化蛋白激酶家族，其可通过对成骨细胞增殖和分化过程的促进，进而诱导血管内皮细胞的形成来发挥对OP的防治作用[31]。EGFR是ERK2的上游信号分子，具有酪氨酸激酶活性，可以通过与表皮生长因子组合，启动细胞核内基因，从而促进细胞分裂[32]。 KEGG通路富集分析得到与OP较为相关的通路有PI3K-AKT、TNF、Wnt、HIF-1、MAPK信号通路。研究表明，PI3K-AKT信号通路参与骨质疏松、骨性关节炎、骨坏死等病理性骨病，并参与调控破骨细胞和成骨细胞的增殖、分化及凋亡[33]。正常生理情况下，PI3K-AKT信号通路可以选择性的影响成骨细胞和破骨细胞的生理功能，保护骨小梁结构，降低破骨细胞分化，通过降低Caspases-9活性，从而减轻细胞损伤所致的细胞凋亡，影响破骨细胞形成[34]。肿瘤坏死因子（TNF）信号通路具有调节破骨细胞活性及骨吸收的作用，其中分离出的糖蛋白骨保护素（Osteoprotegerin，OPG）对骨也具有积极的保护作用[35-36]。Wnt信号通路可以通过抑制MSCs向软骨和成脂谱系的分化，来增强成骨细胞谱系分化[37-38]。成骨细胞和骨细胞的Wnt信号通过OPG的分泌从而间接抑制破骨细胞的分化和骨吸收[39]。Wnt信号通路直接或间接地对成骨细胞和破骨细胞进行调控，在控制骨量与OP的发生发展方面具有重要作用。
综上所述，本研究通过网络药理学和分子对接相结合的方法，筛选出“杜仲-牛膝”药对治疗OP的活性成分，关键靶点和信号通路，发现“杜仲-牛膝”药对可能通过调控细胞增殖、分化与凋亡、骨代谢来治疗OP，具有多成分、多靶点、多系统的特点，并基于分子对接初步模拟其可能的分子作用机制，为“杜仲-牛膝”药对治疗OP机制研究提供了理论依据和线索。鉴于网络药理学及分子对接技术的局限性，其预测结果还需要进一步的研究验证。
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