【摘 要】
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目的 构建家蝇幼虫抗菌肽的真核表达载体,并检测它在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的表达情况.方法 以pUCm-T/Defensin为模板,设计带His标签特异引物,扩增C-末端融合6×His标签的D
【机 构】
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广东医学院寄生虫学与临床寄生虫检验学教研室,广东药学院寄生虫学教研室
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目的 构建家蝇幼虫抗菌肽的真核表达载体,并检测它在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的表达情况.方法 以pUCm-T/Defensin为模板,设计带His标签特异引物,扩增C-末端融合6×His标签的Defensin基因的cDNA全长编码区序列,将其克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体.经酶切及测序鉴定后,以阳离子脂质体Lipofect AmineTM 2000转染CHO细胞,G418抗性筛选稳定转染的阳性克隆细胞,以RT-PCR分析其mRNA的转录情况,通过Ni-NTA琼脂糖柱层析纯化目的蛋白并以Western免疫印迹鉴定蛋白质表达情况.结果 构建了pcDNA3.1 (+)-Defensin-His表达质粒,建立了稳定转染的CHO细胞系.RT- PCR从阳性克隆CHO细胞系中扩增出320 bp大小的目的片段,从转录水平证实pcDNA3.1(+)-Defensin-His重组细胞株表达了Defensin基因.Western免疫印迹检测可见相对分子质量为10000的阳性条带,表明Defensin-His在该细胞系中成功表达.结论 成功构建了质粒pcDNA3.1(+)-Defensin-His,并获得了稳定表达的CHO-Defensin细胞株,有利于进一步研究家蝇幼虫抗菌肽Defensin基因的生物学功能.
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