【摘 要】
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背景与目的:CNC-bZIP是核转录因子E2相关因子2[nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2,NRF2]近羧基端一个亮氨酸拉链结构,该区域是DNA结合以及NRF2与小分子肌腱纤维肉
【机 构】
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同济大学附属杨浦医院呼吸内科,上海,200090
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背景与目的:CNC-bZIP是核转录因子E2相关因子2[nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2,NRF2]近羧基端一个亮氨酸拉链结构,该区域是DNA结合以及NRF2与小分子肌腱纤维肉瘤(small masculoaponeurotic fibrosarcoma,sMaf)蛋白结合形成二聚体所必需的区域,随后该区域与抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)结合,激活NRF2下游靶基因的转录表达,从而增加细胞抗氧化应激能力.构建CRISPR/Cas9慢病毒系统,获得了A549细胞中NRF2基因稳定敲除株并进行了功能研究.方法:针对该结构上下游设计一对sgRNA,与pLenti CRISPR v2载体连接,通过包装慢病毒的方式构建A549稳定敲除细胞系.根据测序图谱及蛋白质印迹法(Western blot)验证敲除效果.然后通过实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)、Western blot检测、克隆形成实验、细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)、划痕实验、Transwell实验比较A549细胞株RF2敲除与不敲除的功能表达.结果:显示A549肺癌细胞中NRF2基因稳定敲除株构建成功;NRF2敲除株下游靶基因mRNA表达及蛋白水平明显减少,且能明显降低A549肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力.结论:利用CRISPR/Cas9慢病毒系统获得了高效永久NRF2基因敲除的肺癌细胞系,该基因敲除后A549肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力都显著降低.
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