咖啡因含量是咖啡的一项重要测试指标。咖啡因的测定方法有薄层色谱法、紫外分光光度法、气相色谱法和高效液相色谱法。为适应一般实验室的需要，本文用紫外分光光度法对速溶咖啡、普通咖啡及咖啡豆中咖啡因的测定方法进行了试验，结果较为满意。本法操作简单、迅速、不需要特殊的试剂及仪器，方法添加回收率为95%~105%，精密度良好，变异系数为2.0%~2.8%，准曲线相关系数为0.999。
　　1 试验方法
　　原理咖啡经加水煮沸，是咖啡因溶于水，用三氯甲烷提取后在276nm波长下测其吸光值与标准比较定量。
　　仪器与试剂755紫外分光光度计；氧化镁，A[⋅]R；三氯甲烷，A[⋅]R；无水硫酸钠，A[⋅]R；咖啡因，生化试剂；咖啡因标准溶液：咖啡因在80℃干燥4h，精确称取50mg溶于水成100ml。取此液20ml移入分液漏斗中，加10%氢氧化钠溶液2ml，氯化钠2g溶解后用三氯甲烷提取三次，每次20ml，合并提取液，经无水硫酸钠脱水过滤于100ml容量瓶中，用三氯甲烷洗涤，合并，定容至刻度。此溶液1ml=100μg咖啡因。
　　操作方法：样品处理及提取咖啡豆、普通咖啡，称取样品（咖啡豆研磨成粉状）1.0g~2.0g；速溶咖啡取0.5g，于250ml烧杯中，加150ml水，盖表面皿，在电炉上煮沸，保持微沸30min，加氧化镁2g，移入250ml容量瓶中，用水冲洗烧杯合并于容量瓶中，放冷后加水至刻度，混匀，过滤。
　　取滤液10ml于分液漏斗中，用三氯甲烷20ml、20ml、10ml提取，提取液经无水硫酸钠（约2g）脱水，并滤于50ml容量瓶中，加三氯甲烷至刻度。同时做空白试验。
　　测定取上述样品的三氯甲烷提取液，用1cm石英杯，以试剂空白调节零点，于波长276nm处测其吸光值，查咖啡因标准曲线，计算其含量。
　　标准曲线取咖啡因标准溶液（1ml=100μg）0.4ml、0.8ml、1.2ml、1.6ml、2.0ml于10ml容量瓶中，加三氯甲烷至刻度。（相当咖啡因4、8、12、16、20μg/ml）用1cm石英比色杯，以三氯甲烷调节零点，于波长276nm处测吸光值，绘制标准曲线。
　　计算[X=A×50×100m×10250×1000×1000]
　　式中：X——样品中咖啡因含量，%；A—测定用样液中咖啡因浓度，μg/ml；m—样品质量，g。
　　2 结果与讨论
　　吸收光谱去浓度为10μg/ml的咖啡因三氯甲烷溶液，在350nm~250nm波长范围内扫描最大吸收峰在276nm±1nm处。
　　氧化镁用量为除去咖啡中色素等杂质，可加入氧化镁吸附沉淀，本法对其加入量进行了选择，取麦氏速溶咖啡三份各0.5g，分别加入2g、5g、10g氧化镁，按本法测定。试验结果无明显区别。本法采用加入2g氧化镁以除干扰。
　　加热时间为使样品中咖啡因最大限度的溶于水，对加热时间进行了试验。取溶咖啡三份各0.5g，普通咖啡三份各1g测定，加热时间分别为20min、30min和1h。结果：三个时间下的数据均无明显区别。为使咖啡因最大限度的溶出，本法用30min煮沸。
　　样品溶液在不同pH下的提取效果：取三份1ml=50μg的咖啡因水溶液，分别调pH6、8、12，依法测定。结果三种pH条件下的提取效果无明显区别。本法加入氧化镁后，样品溶液pH在8~9之间。
　　溶剂提取效果试验取1ml=50μg的咖啡因水溶液2份各10ml，分别用20ml、20ml、10ml和10ml、10ml、10ml三氯甲烷提取测定。结果两种不同体积溶剂的提取效果无明显区别。兼顾提取效果和防止乳化现象，本法采用20ml、20ml、10ml提取。
　　添加回收率试验取速溶及普通咖啡样品，分别添加0.5%~6%咖啡因，结果回收率为95%~105%。