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摘要[目的]对toxR进行副溶血性弧菌特异性检测，探讨toxR靶基因能否准确检测副溶血性弧菌，从而消除其他研究者对该基因特异性的疑虑。[方法]采用SN/T1870—2016中副溶血性弧菌toxR的引物探针对副溶血性弧菌和其亲缘关系接近的弧菌标准菌株进行检测。[结果]采用实时荧光PCR方法证实该引物探针只能扩增出副溶血性弧菌，其他弧菌诸如溶藻弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌等未得到扩增。[结论] 证实SN/T1870—2016中toxR的引物探针特异性高。该研究可为各检测机构提供数据支持，为副溶血性弧菌的检测与研究奠定更为坚实的基础。
关键词副溶血性弧菌;SN/T1870—2016;toxR;弧菌
中图分类号TS201.3文献标识码
A文章编号0517-6611（2017）32-0079-02
Detection Research of Vibrio parahaemolyticus
LIU Xiaoqing，LI Risheng，HUANG Jingmin，LAN Quanxue* et al（Shenzhen Institute of Measurement Quality Inspection，Shenzhen，Guangdong 518131）
Abstract[Objective]The specific detection of toxR in Vibrio parahaemolyticus was used to investigate whether the toxR target gene can detect Vibrio parahaemolyticus accurately，thus it eliminates doubts among other researchers about the specificity of the gene.[Method] The primer and probe of toxR in SN/T 1870—2016 was used to detect Vibrio parahaemolyticus and its Vibrio related standard strain.[Result] The realtime fluorescent PCR method proved that the primer and probe could only amplify Vibrio parahaemolyticus，and other Vibrio species such as Vibrio vulnificus，Vibrio vulnificus and Vibrio cholerae were not amplified.[Conclusion] The specificity of toxR primers and probe in SN/T1870—2016 was confirmed high.This study can provide data support for the testing organization，and lay a more solid foundation for the detection and research of V.Parahaemolyticus.
Key wordsVibrio parahaemolyticus;SN/T1870-2016;toxR;Vibrio spp
作者簡介劉小青（1983—），女，江西万载人，工程师，硕士，从事微生物研究。*通讯作者，高级工程师，硕士，从事食品微生物学研究。
收稿日期2017-08-28
副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种革兰阴性细菌[1]，具有嗜盐性，属于弧菌科弧菌属的食源性致病菌，主要分布在海水和鱼、贝类、虾、海蜇等海产品中，其次为盐腌渍品中，另外畜禽肉、咸蛋、淡水鱼等也会由于交叉污染而传播该菌。由副溶血性弧菌引起的食品安全事故逐年增加，已成为导致食源性疾病的主要致病菌，其对人类的危害已经超过沙门氏菌，因此检测副溶血性弧菌极为重要[2]。
随着分子生物学技术的飞速发展，研究人员和学者们逐渐意识到，对病原微生物的鉴定不能仅局限于对它的外部形态结构及生理特征等一般检验上，而要从分子生物学水平上研究其核酸结构和组成成分。为此，国内外众多的研究人员开始建立起多种以分子生物学技术为手段的食源性致病菌检测技术，这些技术包括常规PCR技术、实时荧光定量PCR 技术、基因芯片技术和以环介导等温扩增技术（LAMP）、重组酶聚合酶扩增（RPA）为代表的等温扩增技术。在我国，一些从实时荧光PCR技术上对致病菌进行快速检测的方法也逐渐被研究应用，其中《出口食品中食源性致病菌检测方法 实时荧光PCR法》SN/T1870—2016是各检测机构最为常用的一个检测方法[3]，该标准涵盖了副溶血性弧菌等12种致病菌的检测。由于副溶血性弧菌与弧菌属其他弧菌的亲缘关系近，有研究者质疑副溶血性靶基因的选择，笔者以SN/T1870—2016为基础，就SN/T1870—2016中副溶血性弧菌的引物探针的特异性进行鉴别，深入研究探讨该标准在副溶血性弧菌的实际应用中的检测效果，以期为各检测机构提供数据支撑。
1材料与方法
1.1材料标准菌株购自各菌种保藏中心等;培养基购自北京陆桥技术有限责任公司;细菌基因组DNA提取试剂盒购自Promega公司;实时荧光PCR反应试剂Premix酶等购自宝生物工程（大连）有限公司;引物、探针由上海生物工程有限公司合成;Mx3005P实时荧光PCR仪，美国安捷伦公司;试验中所用引物见表1[3]，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 1.2方法
1.2.1细菌的培养。副溶血性弧菌标准菌株在3%氯化钠碱性蛋白胨水37 ℃振荡培养18 h复活，其他弧菌在营养肉汤中37 ℃振荡培养18 h复活。
1.2.2菌株DNA模板的制备。
取1.0 mL菌液于1.5 mL离心管中，12 000 r/min离心10 min，去除上清液，收集菌体。加入100 μL灭菌超纯水悬浮，100 ℃沸水中水浴10 min。12 000 r/min离心2 min，取上清液作为PCR反应DNA模板。
1.2.3样品DNA模板的制备。取1.0 mL菌液于1.5 mL离心管中，按照细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。
1.2.4特异性试验。
将副溶血性弧菌和其他弧菌的标准菌株采用增菌液增菌后，按“1.2.3”方法制备DNA模板，采用25 μL 体系进行特异性试验，体系为2× premix 12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，探针0.5 μL， ddH2O 8.0 μL， DNA模板2.0 μL。PCR扩增条件：95 ℃ 3 min;95 ℃ 5 s， 60 ℃ 40 s 并收集FAM荧光，进行40个循环。
2结果与分析
扩增结果见图1和表2。SN/T1870—2016中的副溶血性弧菌PCR体系特异地检出了副溶血性弧菌，而其他与其亲缘关系邻近种属的弧菌未见到非特异扩增现象，这表明该引物探针的特异性高。
采用分子方法尤其是SN/T1870—2016對其进行快速检测已是常规检测手段。但由于副溶血性弧菌与弧菌属其他
弧菌的亲缘关系极为相近，有研究者质疑副溶血性toxR靶基因的選择，认为toxR基因无法区分副溶血性弧菌与非副溶血性弧菌，而该研究所选用菌株均为与副溶血性弧菌亲缘关系极为相近的菌株，结果证实SN/T1870—2016中toxR的引物探针特异性高，从而使上述质疑得到释疑。
3讨论
该研究结果证实，SN/T1870—2016中toxR的引物探针特异性高，可以有效地将副溶血性弧菌从亲缘关系相近弧菌中区别开。然而，近些年以来，随着分子生物学的发展，研究人员逐渐采用荧光PCR等分子生物学手段对副溶血性弧菌进行快速检测，SN/T1870—2016采用toxR基因作为副溶血性弧菌的靶基因，它是弧菌中广泛分布的基因，为霍乱毒素的调控子及其他基因的调控子，该基因主要与toxS构成两成分系统（toxRS）对毒力基因进行表达调控，已有很多文献报道利用toxR鉴定副溶血性弧菌，并表现出很高的特异性和灵敏度[4-6]，但依然也有很多外国学者对该靶基因提出了质疑。Kim 对373株副溶血性弧菌和290株非副溶血弧菌属采用toxR基因进行了菌落PCR，发现373株副溶血性弧菌全部阳性，但是弧菌属的其他4个种（溶藻弧菌、坎氏弧菌、鲨鱼弧菌、哈氏弧菌）有弱阳性出现。由于副溶血性弧菌与弧菌属的其他弧菌如霍乱弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌等亲缘关系极为密切，16sRNAR分析发现，其与溶藻弧菌的的同源性高达99%[7]。也有文献报道，副溶血性弧菌与气单胞菌属和发光杆菌属毒素基因也有交叉反应[8]。因此在该研究中，笔者选取了2株副溶血性弧菌标准菌株、9株弧菌属的其他弧菌、气单胞菌属和发光杆菌共12株菌作为非副溶血性弧菌的代表，对所选引物探针进行特异性试验，着重探讨其对临近种属的特异性。结果表明，SN/T1870—2016中副溶血性弧菌的特异性很高，仅扩增副溶血性弧菌，其他临近种属的菌未得到扩增。通过NCBI将引物和探针序列进行blast发现，比对结果中只有副溶血性弧菌出现，进一步证实该引物探针特异性高，与笔者的试验结果一致。该研究解除了利用SN/T1870—2016中的副溶血性弧菌引物探针特异性不高的疑虑，可为各检测机构提供数据支持，为副溶血性弧菌的检测与研究奠定更为坚实的基础。
参考文献
[1]
FUJINO T，OKUNO Y，NAKADA D，et al.On the bacteriological examination of shirasufood poisoning[J].Med J Osaka Univ，1953，4（2/3）：299-304.
[2] 陈晶，黄建飞，刘丛丛.食品来源副溶血性弧菌毒力基因分布及分子分型研究[J].食品工业科技，2016，37（6）：239-249.
[3] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.出口食品中食源性致病菌检测方法 实时荧光PCR法：SN/T 1870—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.
[4]
马立芝，郭李平，邱业峰.副溶血弧菌的致病机制[J].生物技术通讯，2013，24（6）：871-876.
[5] 苏靖华，章红红，傅慧琴，等.副溶血性弧菌160株血清群型分布和耐药性分析[J].上海预防医学，2012，24（3）：135-138.
[6] 林佳琪，苏国成，黄建炜，等.四重PCR检测副溶血性弧菌及其毒力基因方法的建立[J].微生物学通报，2016，43（11）：2521-2529.
[7] KIM Y B，OKUDA J，MATSUMOTO C，et al.Identification of Vibrio parahaemolyticus strains at the species level by PCR targeted to the toxR gene[J].Journal of clinical microbiology，1999，37（4）：1173-1177.
[8] KLEIN S L，GUTIERREZ WEST C K，MEJIA D M，et al.Genes similar to the Vibrio parahaemolyticus virulencerelated genes tdh，tlh and vscC2 occur in other Vibrionaceae species isolated from a pristine esturary[J].Applies and environmental microbiology，2014，80（2）：595-602.
关键词副溶血性弧菌;SN/T1870—2016;toxR;弧菌
中图分类号TS201.3文献标识码
A文章编号0517-6611（2017）32-0079-02
Detection Research of Vibrio parahaemolyticus
LIU Xiaoqing，LI Risheng，HUANG Jingmin，LAN Quanxue* et al（Shenzhen Institute of Measurement Quality Inspection，Shenzhen，Guangdong 518131）
Abstract[Objective]The specific detection of toxR in Vibrio parahaemolyticus was used to investigate whether the toxR target gene can detect Vibrio parahaemolyticus accurately，thus it eliminates doubts among other researchers about the specificity of the gene.[Method] The primer and probe of toxR in SN/T 1870—2016 was used to detect Vibrio parahaemolyticus and its Vibrio related standard strain.[Result] The realtime fluorescent PCR method proved that the primer and probe could only amplify Vibrio parahaemolyticus，and other Vibrio species such as Vibrio vulnificus，Vibrio vulnificus and Vibrio cholerae were not amplified.[Conclusion] The specificity of toxR primers and probe in SN/T1870—2016 was confirmed high.This study can provide data support for the testing organization，and lay a more solid foundation for the detection and research of V.Parahaemolyticus.
Key wordsVibrio parahaemolyticus;SN/T1870-2016;toxR;Vibrio spp
作者簡介劉小青（1983—），女，江西万载人，工程师，硕士，从事微生物研究。*通讯作者，高级工程师，硕士，从事食品微生物学研究。
收稿日期2017-08-28
副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种革兰阴性细菌[1]，具有嗜盐性，属于弧菌科弧菌属的食源性致病菌，主要分布在海水和鱼、贝类、虾、海蜇等海产品中，其次为盐腌渍品中，另外畜禽肉、咸蛋、淡水鱼等也会由于交叉污染而传播该菌。由副溶血性弧菌引起的食品安全事故逐年增加，已成为导致食源性疾病的主要致病菌，其对人类的危害已经超过沙门氏菌，因此检测副溶血性弧菌极为重要[2]。
随着分子生物学技术的飞速发展，研究人员和学者们逐渐意识到，对病原微生物的鉴定不能仅局限于对它的外部形态结构及生理特征等一般检验上，而要从分子生物学水平上研究其核酸结构和组成成分。为此，国内外众多的研究人员开始建立起多种以分子生物学技术为手段的食源性致病菌检测技术，这些技术包括常规PCR技术、实时荧光定量PCR 技术、基因芯片技术和以环介导等温扩增技术（LAMP）、重组酶聚合酶扩增（RPA）为代表的等温扩增技术。在我国，一些从实时荧光PCR技术上对致病菌进行快速检测的方法也逐渐被研究应用，其中《出口食品中食源性致病菌检测方法 实时荧光PCR法》SN/T1870—2016是各检测机构最为常用的一个检测方法[3]，该标准涵盖了副溶血性弧菌等12种致病菌的检测。由于副溶血性弧菌与弧菌属其他弧菌的亲缘关系近，有研究者质疑副溶血性靶基因的选择，笔者以SN/T1870—2016为基础，就SN/T1870—2016中副溶血性弧菌的引物探针的特异性进行鉴别，深入研究探讨该标准在副溶血性弧菌的实际应用中的检测效果，以期为各检测机构提供数据支撑。
1材料与方法
1.1材料标准菌株购自各菌种保藏中心等;培养基购自北京陆桥技术有限责任公司;细菌基因组DNA提取试剂盒购自Promega公司;实时荧光PCR反应试剂Premix酶等购自宝生物工程（大连）有限公司;引物、探针由上海生物工程有限公司合成;Mx3005P实时荧光PCR仪，美国安捷伦公司;试验中所用引物见表1[3]，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 1.2方法
1.2.1细菌的培养。副溶血性弧菌标准菌株在3%氯化钠碱性蛋白胨水37 ℃振荡培养18 h复活，其他弧菌在营养肉汤中37 ℃振荡培养18 h复活。
1.2.2菌株DNA模板的制备。
取1.0 mL菌液于1.5 mL离心管中，12 000 r/min离心10 min，去除上清液，收集菌体。加入100 μL灭菌超纯水悬浮，100 ℃沸水中水浴10 min。12 000 r/min离心2 min，取上清液作为PCR反应DNA模板。
1.2.3样品DNA模板的制备。取1.0 mL菌液于1.5 mL离心管中，按照细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。
1.2.4特异性试验。
将副溶血性弧菌和其他弧菌的标准菌株采用增菌液增菌后，按“1.2.3”方法制备DNA模板，采用25 μL 体系进行特异性试验，体系为2× premix 12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，探针0.5 μL， ddH2O 8.0 μL， DNA模板2.0 μL。PCR扩增条件：95 ℃ 3 min;95 ℃ 5 s， 60 ℃ 40 s 并收集FAM荧光，进行40个循环。
2结果与分析
扩增结果见图1和表2。SN/T1870—2016中的副溶血性弧菌PCR体系特异地检出了副溶血性弧菌，而其他与其亲缘关系邻近种属的弧菌未见到非特异扩增现象，这表明该引物探针的特异性高。
采用分子方法尤其是SN/T1870—2016對其进行快速检测已是常规检测手段。但由于副溶血性弧菌与弧菌属其他
弧菌的亲缘关系极为相近，有研究者质疑副溶血性toxR靶基因的選择，认为toxR基因无法区分副溶血性弧菌与非副溶血性弧菌，而该研究所选用菌株均为与副溶血性弧菌亲缘关系极为相近的菌株，结果证实SN/T1870—2016中toxR的引物探针特异性高，从而使上述质疑得到释疑。
3讨论
该研究结果证实，SN/T1870—2016中toxR的引物探针特异性高，可以有效地将副溶血性弧菌从亲缘关系相近弧菌中区别开。然而，近些年以来，随着分子生物学的发展，研究人员逐渐采用荧光PCR等分子生物学手段对副溶血性弧菌进行快速检测，SN/T1870—2016采用toxR基因作为副溶血性弧菌的靶基因，它是弧菌中广泛分布的基因，为霍乱毒素的调控子及其他基因的调控子，该基因主要与toxS构成两成分系统（toxRS）对毒力基因进行表达调控，已有很多文献报道利用toxR鉴定副溶血性弧菌，并表现出很高的特异性和灵敏度[4-6]，但依然也有很多外国学者对该靶基因提出了质疑。Kim 对373株副溶血性弧菌和290株非副溶血弧菌属采用toxR基因进行了菌落PCR，发现373株副溶血性弧菌全部阳性，但是弧菌属的其他4个种（溶藻弧菌、坎氏弧菌、鲨鱼弧菌、哈氏弧菌）有弱阳性出现。由于副溶血性弧菌与弧菌属的其他弧菌如霍乱弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌等亲缘关系极为密切，16sRNAR分析发现，其与溶藻弧菌的的同源性高达99%[7]。也有文献报道，副溶血性弧菌与气单胞菌属和发光杆菌属毒素基因也有交叉反应[8]。因此在该研究中，笔者选取了2株副溶血性弧菌标准菌株、9株弧菌属的其他弧菌、气单胞菌属和发光杆菌共12株菌作为非副溶血性弧菌的代表，对所选引物探针进行特异性试验，着重探讨其对临近种属的特异性。结果表明，SN/T1870—2016中副溶血性弧菌的特异性很高，仅扩增副溶血性弧菌，其他临近种属的菌未得到扩增。通过NCBI将引物和探针序列进行blast发现，比对结果中只有副溶血性弧菌出现，进一步证实该引物探针特异性高，与笔者的试验结果一致。该研究解除了利用SN/T1870—2016中的副溶血性弧菌引物探针特异性不高的疑虑，可为各检测机构提供数据支持，为副溶血性弧菌的检测与研究奠定更为坚实的基础。
参考文献
[1]
FUJINO T，OKUNO Y，NAKADA D，et al.On the bacteriological examination of shirasufood poisoning[J].Med J Osaka Univ，1953，4（2/3）：299-304.
[2] 陈晶，黄建飞，刘丛丛.食品来源副溶血性弧菌毒力基因分布及分子分型研究[J].食品工业科技，2016，37（6）：239-249.
[3] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.出口食品中食源性致病菌检测方法 实时荧光PCR法：SN/T 1870—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.
[4]
马立芝，郭李平，邱业峰.副溶血弧菌的致病机制[J].生物技术通讯，2013，24（6）：871-876.
[5] 苏靖华，章红红，傅慧琴，等.副溶血性弧菌160株血清群型分布和耐药性分析[J].上海预防医学，2012，24（3）：135-138.
[6] 林佳琪，苏国成，黄建炜，等.四重PCR检测副溶血性弧菌及其毒力基因方法的建立[J].微生物学通报，2016，43（11）：2521-2529.
[7] KIM Y B，OKUDA J，MATSUMOTO C，et al.Identification of Vibrio parahaemolyticus strains at the species level by PCR targeted to the toxR gene[J].Journal of clinical microbiology，1999，37（4）：1173-1177.
[8] KLEIN S L，GUTIERREZ WEST C K，MEJIA D M，et al.Genes similar to the Vibrio parahaemolyticus virulencerelated genes tdh，tlh and vscC2 occur in other Vibrionaceae species isolated from a pristine esturary[J].Applies and environmental microbiology，2014，80（2）：595-602.