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摘要 炭疽菌Colletotrichum和链格孢Alternaria是引起植物病害的重要真菌，给农业生产造成巨大的损失。本研究选取13种萜类化合物，采用菌丝生长速率法对胶孢炭疽菌、链格孢进行抑菌活性分析。研究结果表明：香芹酚、丁香酚、异丁香酚、枯茗醛、百里香酚对两种病原菌有较好的抑菌活性，其中香芹酚对胶孢炭疽菌和链格孢的抑菌活性最强，IC50分别为40.89 μg/mL和18.19 μg/mL。本试验为植物精油和天然杀菌剂的开发利用提供理论依据。
关键词 萜类化合物； 抑菌活性； 胶孢炭疽菌； 链格孢
中图分类号： S432
文献标识码： A
DOI： 10.3969/j.issn.05291542.2017.02.034
Abstract Colletotrichum and Alternaria are the important plant pathogenic fungi， which have caused great loss to agricultural production. 13 terpenoid compounds were selected to test their antifungal activity on Colletotrichum gloeosporioides and Alternaria sp. by mycelium growth rate method. The results showed that carvacrol， eugenol， isoeugenol， cuminaldehyde and thymol had good antimicrobial activities on the two pathogens， and the antifungal activity of carvacrol was the strongest with the IC50 values of 40.89 μg/L and 18.19 μg/L， respectively. The results provide theory basis for development and utilization of the plant essential oil and natural fungicide.
Key words terpenoid compounds； antifungal activity； Colletotrichum gloeosporioides； Alternaria sp.
炭疽菌Colletotrichum和链格孢Alternaria引起的植物病害，给农业生产造成巨大的损失[12]。在长期的选择压力下，病原菌抗药性不断增强，常用药剂防治效果逐年下降。因此，寻找新型农药、加强病原菌抗药性治理成为病害综合防治的迫切需要。
精油是从植物中提取的具有挥发性、分子量较小的次生代谢物质[3]。其成分较为复杂，包含芳香族化合物、脂肪族化合物、萜类化合物、含硫含氮化合物及其含氧衍生物如酮、酚、醛、醇、酸、酯等[4]。研究表明：精油具有抑菌活性强、不易产生抗性等优点，是一种安全有效的天然杀菌剂[57]。本文选取酮、酚、醛等13种萜类化合物，研究其对胶孢炭疽菌和链格孢的活性，筛选活性好的萜类化合物，以期为植物提取物的利用和天然杀菌剂的开发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试萜类化合物
丁香酚 （eugenol）、百里香酚（thymol）、香芹酚 （carvacrol）、异丁香酚（isoeugenol）、薄荷酮[（-）menthone]、香芹酮[（-）carvone]、长叶薄荷酮[（ ）pulegone]、马鞭草烯酮[（-）verbenone]、小茴
香酮[（-）fenchone]、莰酮[（ ）camphor]、柠檬醛（citral）、香茅醛（citronellal）、枯茗醛（cuminaldehyde）均购于梯希爱（上海）化成工业发展有限公司，纯度大于95%。
1.1.2 病原菌
胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides和链格孢Alternaria sp.从湖北孝感市区油茶病株上采集，利用常规组织分离法分离纯化病原菌，观察其形态学特征，结合其 rDNAITS 序列分析对病原菌进行分子鉴定[8]。
1.2 试验方法
1.2.1 萜类化合物抑菌活性的测定
采用菌丝生长速率法测定萜类化合物的抑菌活性。在无菌条件下，将灭菌的PDA培养基（马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g、纯净水1 000 mL）冷却至50℃左右，将40 mg萜类化合物加入100 mL培养基中，配成浓度为400 μg/mL的混合物，充分摇匀，倒入直径9 cm 的培养皿中，每皿大约20 mL。用6 mm的打孔器在培养好的供试菌菌落边缘打取长势相同的菌饼接入培养皿中央，每皿一枚，3次重复，以PDA为空白对照。倒置培养，培养条件为28℃。待对照长满培养皿后，用十字交叉法测量菌落直径，计算萜类化合物对供试菌的抑制率。
1.2.2 不同浓度萜类化合物抑菌活性的测定
将1.2.1测定的抑菌率大于50%的萜类化合物进行不同浓度梯度活性测定，浓度梯度为50、100、200、400 μg/mL，方法同1.2.1。
1.2.3 数据处理
试验数据处理采用Excel 2010和SPSS 19.0統计分析软件。抑菌率用SPSS软件进行单因素方差分析，采用Duncan氏新复极差法进行差异多重比较（P<0.05）。IC50利用SPSS软件中回归分析的Probit进行计算。 抑菌率（%）=[（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径-菌饼直径] ×100。
2 结果与分析
2.1 13种萜类化合物对两种病菌菌丝生长的抑制作用
以菌丝生长速率法测定13种萜类化合物对胶孢炭疽菌和链格孢菌丝生长的抑制作用。结果（表1）表明除薄荷酮、莰酮和香茅醛对胶孢炭疽菌无抑菌活性；小茴香酮、薄荷酮和香芹酮对链格孢无抑菌活性外，其他精油对两种病菌均具有抑制活性，其中丁香酚和香芹酚的抑菌效果最好，对2种病原菌的抑菌率均为100%。其次为异丁香酚、枯茗醛和百里香酚。
2.2 优选出的5种萜类化合物对两种病菌的IC50
根据2.1结果，香芹酚、异丁香酚等5种萜类化合物在浓度400 μg/mL时具有较好的抗病菌活性，为了进一步探索其抑菌活性，将选出来的5种萜类化合物进行浓度梯度活性试验，测定其对胶孢炭疽菌和链格孢的抑菌率，结果（图1～2）表明：这5种萜类化合物对胶孢炭疽菌菌丝生长抑制活性为：香芹酚>丁香酚>异丁香酚>枯茗醛>百里香酚，其对应的IC50（表2）分别为40.89、42.95、88.86、170.58、348.56 μg/mL。经5种萜类化合物不同浓度梯度处理后菌落生长情况见图3。精油对链格孢菌丝生长抑制活性为：香芹酚>异丁香酚>丁香酚>枯茗醛>百里香酚，其对应的IC50分别为18.19、22.43、114.64、339.35、384.65 μg/mL。
3 讨论
本文研究了13种萜类化合物的抑菌活性，结果表明：香芹酚、丁香酚、异丁香酚、枯茗醛、百里香酚对两种病原菌的抑菌活性较好，其中抑菌活性最好的是香芹酚。
香芹酚，又名香芹芥酚，它是百里香油、牛至油、山地椒油等植物提取物的主要成分。因其具有抑菌、杀虫、抗氧化等作用[911]，引起人们的关注。王新伟等[1213]采用纸片扩散法和双倍稀释法研究发现香芹酚对大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、面包酵母Saccharomyces cerevisiae、黑曲霉Aspergillus niger均有明显的抑制作用。Ultee等[14]研究发现香芹酚可以改变枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis细胞膜中脂肪酸的结构和比例，从而抑制其生长。香芹酚不但对植物病害具有一定的抑制活性，对植物虫害同样具有活性，如王玲等[15]研究发现香芹酚对黏虫有较好的毒杀活性，用其处理24 h后的半致死浓度（LC50）为12.7 mg/L。张静等[16]研究发现香芹酚对朱砂叶螨有较强的毒杀活性，在供试浓度为1 g/L时，处理24 h后其校正死亡率达到100%，还可以抑制朱砂叶螨产卵，产卵抑制率高达87.95%。
本文首次发现香芹酚对胶孢炭疽菌、链格孢具有抑制活性，这不仅为下一步研究其抑菌机制和作用方式奠定基础，也为将香芹酚开发成天然杀菌剂应用于农业生产实践提供理论依据。
参考文献
[1] 高芬， 吴元华. 链格孢属（Alternaria）真菌病害的生物防治研究进展[J]. 植物保护， 2008， 34（3）：16.
[2] 刘晓云， 景耀， 杨俊秀. 植物炭疽菌研究文献综述[J]. 西北林学院学报， 1995（4）：105111.
[3] 胡林峰， 许明录， 朱红霞. 植物精油抑菌活性研究进展[J]. 天然产物研究与开发， 2011，23（2）： 384391.
[4] 王巨媛， 翟胜. 植物精油应用进展及开发前景展望[J]. 江苏农业科学， 2010（4）： 13.
[5] 李永刚， 文景芝， 郝中娜. 植物源杀菌剂的研究现状与展望[J]. 东北农业大学学报， 2002， 33（2）： 198202.
[6] 王树桐， 曹克强， 张凤巧， 等. 中药丁香提取物对番茄灰霉病菌抑制作用及生防效果[J]. 植物病理学报， 2005， 35（6）： 9194.
[7] Di Vaio C， Graziani G， Gaspari A， et al. Essential oils content and antioxidant properties of peel ethanol extract in 18 lemon cultivars[J]. Scientia Horticulturae， 2010， 126（1）： 5055.
[8] 史紅安， 傅本重， 张志林， 等. 侵染油茶的两种病原菌的鉴定及其生物学特性研究[J]. 湖北农业科学， 2015（23）：59085911.
[9] Lambert R J， Skandamis P N， Coote P J， et al. A study of the minimum inhibitory concentration and mode of action of oregano essential oil， thymol and carvacrol [J]. Journal of Applied Microbiology， 2001， 91（3）： 453462.
[10]Chami N， Bennis S， Chami F， et al. Study of anticandidal activity of carvacrol and eugenol in vitro and in vivo [J]. Oral Microbiology
关键词 萜类化合物； 抑菌活性； 胶孢炭疽菌； 链格孢
中图分类号： S432
文献标识码： A
DOI： 10.3969/j.issn.05291542.2017.02.034
Abstract Colletotrichum and Alternaria are the important plant pathogenic fungi， which have caused great loss to agricultural production. 13 terpenoid compounds were selected to test their antifungal activity on Colletotrichum gloeosporioides and Alternaria sp. by mycelium growth rate method. The results showed that carvacrol， eugenol， isoeugenol， cuminaldehyde and thymol had good antimicrobial activities on the two pathogens， and the antifungal activity of carvacrol was the strongest with the IC50 values of 40.89 μg/L and 18.19 μg/L， respectively. The results provide theory basis for development and utilization of the plant essential oil and natural fungicide.
Key words terpenoid compounds； antifungal activity； Colletotrichum gloeosporioides； Alternaria sp.
炭疽菌Colletotrichum和链格孢Alternaria引起的植物病害，给农业生产造成巨大的损失[12]。在长期的选择压力下，病原菌抗药性不断增强，常用药剂防治效果逐年下降。因此，寻找新型农药、加强病原菌抗药性治理成为病害综合防治的迫切需要。
精油是从植物中提取的具有挥发性、分子量较小的次生代谢物质[3]。其成分较为复杂，包含芳香族化合物、脂肪族化合物、萜类化合物、含硫含氮化合物及其含氧衍生物如酮、酚、醛、醇、酸、酯等[4]。研究表明：精油具有抑菌活性强、不易产生抗性等优点，是一种安全有效的天然杀菌剂[57]。本文选取酮、酚、醛等13种萜类化合物，研究其对胶孢炭疽菌和链格孢的活性，筛选活性好的萜类化合物，以期为植物提取物的利用和天然杀菌剂的开发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试萜类化合物
丁香酚 （eugenol）、百里香酚（thymol）、香芹酚 （carvacrol）、异丁香酚（isoeugenol）、薄荷酮[（-）menthone]、香芹酮[（-）carvone]、长叶薄荷酮[（ ）pulegone]、马鞭草烯酮[（-）verbenone]、小茴
香酮[（-）fenchone]、莰酮[（ ）camphor]、柠檬醛（citral）、香茅醛（citronellal）、枯茗醛（cuminaldehyde）均购于梯希爱（上海）化成工业发展有限公司，纯度大于95%。
1.1.2 病原菌
胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides和链格孢Alternaria sp.从湖北孝感市区油茶病株上采集，利用常规组织分离法分离纯化病原菌，观察其形态学特征，结合其 rDNAITS 序列分析对病原菌进行分子鉴定[8]。
1.2 试验方法
1.2.1 萜类化合物抑菌活性的测定
采用菌丝生长速率法测定萜类化合物的抑菌活性。在无菌条件下，将灭菌的PDA培养基（马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g、纯净水1 000 mL）冷却至50℃左右，将40 mg萜类化合物加入100 mL培养基中，配成浓度为400 μg/mL的混合物，充分摇匀，倒入直径9 cm 的培养皿中，每皿大约20 mL。用6 mm的打孔器在培养好的供试菌菌落边缘打取长势相同的菌饼接入培养皿中央，每皿一枚，3次重复，以PDA为空白对照。倒置培养，培养条件为28℃。待对照长满培养皿后，用十字交叉法测量菌落直径，计算萜类化合物对供试菌的抑制率。
1.2.2 不同浓度萜类化合物抑菌活性的测定
将1.2.1测定的抑菌率大于50%的萜类化合物进行不同浓度梯度活性测定，浓度梯度为50、100、200、400 μg/mL，方法同1.2.1。
1.2.3 数据处理
试验数据处理采用Excel 2010和SPSS 19.0統计分析软件。抑菌率用SPSS软件进行单因素方差分析，采用Duncan氏新复极差法进行差异多重比较（P<0.05）。IC50利用SPSS软件中回归分析的Probit进行计算。 抑菌率（%）=[（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径-菌饼直径] ×100。
2 结果与分析
2.1 13种萜类化合物对两种病菌菌丝生长的抑制作用
以菌丝生长速率法测定13种萜类化合物对胶孢炭疽菌和链格孢菌丝生长的抑制作用。结果（表1）表明除薄荷酮、莰酮和香茅醛对胶孢炭疽菌无抑菌活性；小茴香酮、薄荷酮和香芹酮对链格孢无抑菌活性外，其他精油对两种病菌均具有抑制活性，其中丁香酚和香芹酚的抑菌效果最好，对2种病原菌的抑菌率均为100%。其次为异丁香酚、枯茗醛和百里香酚。
2.2 优选出的5种萜类化合物对两种病菌的IC50
根据2.1结果，香芹酚、异丁香酚等5种萜类化合物在浓度400 μg/mL时具有较好的抗病菌活性，为了进一步探索其抑菌活性，将选出来的5种萜类化合物进行浓度梯度活性试验，测定其对胶孢炭疽菌和链格孢的抑菌率，结果（图1～2）表明：这5种萜类化合物对胶孢炭疽菌菌丝生长抑制活性为：香芹酚>丁香酚>异丁香酚>枯茗醛>百里香酚，其对应的IC50（表2）分别为40.89、42.95、88.86、170.58、348.56 μg/mL。经5种萜类化合物不同浓度梯度处理后菌落生长情况见图3。精油对链格孢菌丝生长抑制活性为：香芹酚>异丁香酚>丁香酚>枯茗醛>百里香酚，其对应的IC50分别为18.19、22.43、114.64、339.35、384.65 μg/mL。
3 讨论
本文研究了13种萜类化合物的抑菌活性，结果表明：香芹酚、丁香酚、异丁香酚、枯茗醛、百里香酚对两种病原菌的抑菌活性较好，其中抑菌活性最好的是香芹酚。
香芹酚，又名香芹芥酚，它是百里香油、牛至油、山地椒油等植物提取物的主要成分。因其具有抑菌、杀虫、抗氧化等作用[911]，引起人们的关注。王新伟等[1213]采用纸片扩散法和双倍稀释法研究发现香芹酚对大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、面包酵母Saccharomyces cerevisiae、黑曲霉Aspergillus niger均有明显的抑制作用。Ultee等[14]研究发现香芹酚可以改变枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis细胞膜中脂肪酸的结构和比例，从而抑制其生长。香芹酚不但对植物病害具有一定的抑制活性，对植物虫害同样具有活性，如王玲等[15]研究发现香芹酚对黏虫有较好的毒杀活性，用其处理24 h后的半致死浓度（LC50）为12.7 mg/L。张静等[16]研究发现香芹酚对朱砂叶螨有较强的毒杀活性，在供试浓度为1 g/L时，处理24 h后其校正死亡率达到100%，还可以抑制朱砂叶螨产卵，产卵抑制率高达87.95%。
本文首次发现香芹酚对胶孢炭疽菌、链格孢具有抑制活性，这不仅为下一步研究其抑菌机制和作用方式奠定基础，也为将香芹酚开发成天然杀菌剂应用于农业生产实践提供理论依据。
参考文献
[1] 高芬， 吴元华. 链格孢属（Alternaria）真菌病害的生物防治研究进展[J]. 植物保护， 2008， 34（3）：16.
[2] 刘晓云， 景耀， 杨俊秀. 植物炭疽菌研究文献综述[J]. 西北林学院学报， 1995（4）：105111.
[3] 胡林峰， 许明录， 朱红霞. 植物精油抑菌活性研究进展[J]. 天然产物研究与开发， 2011，23（2）： 384391.
[4] 王巨媛， 翟胜. 植物精油应用进展及开发前景展望[J]. 江苏农业科学， 2010（4）： 13.
[5] 李永刚， 文景芝， 郝中娜. 植物源杀菌剂的研究现状与展望[J]. 东北农业大学学报， 2002， 33（2）： 198202.
[6] 王树桐， 曹克强， 张凤巧， 等. 中药丁香提取物对番茄灰霉病菌抑制作用及生防效果[J]. 植物病理学报， 2005， 35（6）： 9194.
[7] Di Vaio C， Graziani G， Gaspari A， et al. Essential oils content and antioxidant properties of peel ethanol extract in 18 lemon cultivars[J]. Scientia Horticulturae， 2010， 126（1）： 5055.
[8] 史紅安， 傅本重， 张志林， 等. 侵染油茶的两种病原菌的鉴定及其生物学特性研究[J]. 湖北农业科学， 2015（23）：59085911.
[9] Lambert R J， Skandamis P N， Coote P J， et al. A study of the minimum inhibitory concentration and mode of action of oregano essential oil， thymol and carvacrol [J]. Journal of Applied Microbiology， 2001， 91（3）： 453462.
[10]Chami N， Bennis S， Chami F， et al. Study of anticandidal activity of carvacrol and eugenol in vitro and in vivo [J]. Oral Microbiology